Существующие два пути интенсификации биодеградации ксенобиотиков в окружающей среде – стимуляция естественной микрофлоры и интродукция активных штаммов, не только не противоречат, но и дополняют друг – друга (Коронелли, 1996).
Биорекультивация нефтезагрязненных почв – это многостадийный биотехнологический процесс, включающий физико-химические методы детоксикации загрязнителя, применение органических и минеральных добавок, использование биопрепаратов (Вельков,1995).
Основными факторами, влияющими на ход биоразрушения органических загрязнителей, являются их химическая природа (которая обусловливает возможные пути биотрансформации), концентрация и взаимодействие с другими загрязнителями (на уровне их непосредственного взаимодействия или взаимного влияния на трансформацию).
К неблагоприятным физико-химическим условиям, лимитирующим деградацию микроорганизмами ксенобиотиков в окружающей среде, можно отнести низкую или чрезмерную влажность почвы, недостаточное содержание кислорода, неблагоприятную температуру и рH, низкую концентрацию или доступность ксенобиотиков, наличие альтернативных, более предпочтительных субстратов и т.д.. Среди биологических факторов отмечены поедание интродуцируемых микроорганизмов простейшими, обмен генетической информацией в популяции, физиологическое состояние и плотность интродуцируемой микробной популяции (Providenti, 1993). Некоторые из перечисленных проблем могут быть решены путем создания генетически сконструированных штаммов-деструкторов и их консорциумов, усовершенствования методов интродукции, оптимизации условий существования природных микробных популяций.
Таким образом, интродукция микроорганизмов приводит к положительным результатам только при создании соответствующих условий для развития внесенной популяции, для чего необходимо знать физиологические особенности интродуцента, а также учитывать складывающиеся микробные взаимодействия.
3.3 Микроорганизмы-деструкторы нефти и нефтепродуктов
Способность усваивать углеводороды нефти присуща микроорганизмам, представленным различными систематическими группами. К ним относятся различные виды микромицетов, дрожжей и бактерий. Наиболее активные деструкторы нефти встречаются среди бактерий. Они характеризуются способностью к усвоению широкого спектра углеводородов, включая и ароматические, обладают высокой скоростью роста и, следовательно, представляют большой практический интерес.
Углеводородокисляющая группа микроорганизмов природного происхождения таксономически очень разнообразна. Наиболее активные бактериальные штаммы относятся к родам: Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Acinetobacter, Flavobacterium, Corynebacterium, Xanthomonas, Alcaligenes, Nocardia, Brevibacterium, Mycobacterium, Beijerinkia, Bacillus, Enterobacteriaceae, Klebsiella, Micrococcus, Sphaerotilus. Среди актиномицетов внимание привлекает многочисленный род Streptomyces. Из дрожжей выделяют род Candida и Torulopsis (Сидоров и др., 1997).
Постоянными и доминирующими компонентами естественных биоценозов нефтяных загрязнений являются родококки, их основная экологическая функция – аккумуляция газообразных н-алканов, жидких углеводородов нефти и трансформация их в биомассу. Бактерии этого рода отличаются высокой жизнестойкостью при действии неблагоприятных факторов – низкой температуры, солнечного ультрафиолета, длительного отсутствия питательных веществ. Естественная нефтеокисляющая микрофлора нефтезагрязненной тундровой почвы представлена главным образом бактериями R. Erythropolis. В связи с этим понятен интерес к родококкам – деструкторам нефти (Коронелли, 1996).
Т. В. Коронелли с соавт. с целью выбора штамма, сохраняющего в наибольшей степени углеводородокисляющую активность при низких температурах, провели скрининг всей коллекции углеводородокисляющих бактерий (роды Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus) в агаризованной среде с парафином при температуре плюс 6°С. Отобранные таким образом 17 штаммов выращивали в жидкой среде с нефтью при плюс 8°С. Через 14 суток определяли концентрацию нефтяных углеводородов методом ИК-спектроскопии. Оказалось, что 12 штаммов использовали от 13 до 36% внесенной нефти, два штамма – 5-6%, а три были неэффективными. Все 12 штаммов являлись представителями рода Rhodococcus: 11 принадлежали к виду R. Erythropolis; один – к виду R. Maris (Коронелли, 1996).
Немалый интерес представляют спорообразующие бактерии, так как они наиболее устойчивы к различным неблагоприятным воздействиям окружающей среды.
В настоящее время активно ведётся поиск микроорганизмов, разрушающих нефть, в особенности при низких температурах. Активные формы микроорганизмов выделяются из разнообразных водных и почвенных экосистем, особенно загрязнённых углеводородами или нефтью, а также из микрофлоры нефти и пластовых вод нефтяных месторождений.
Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородных загрязнений должен производиться с учетом ряда требований. При поиске микроорганизма-деструктора необходимо учитывать, что вносимая в почву микробная биомасса не должна быть чужеродной для почвенной микрофлоры. Еще одним важным требованием к вносимым в почву микроорганизмам является их непатогенность. В связи с тем, что технология микробиологической очистки загрязненных почв предусматривает аэробные условия, необходимо вести выбор микроорганизма-деструктора среди аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов. Микробные клетки могут подвергаться воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды, следовательно, микроорганизм-деструктор должен обладать высокой жизнестойкостью.
В настоящее время предложено большое количество различных коммерческих микробиологических препаратов как отечественного, так и импортного производства. Ряд из них нашел широкое применение на практике (Деворойл, Дестройл, Путидойл и т.п.)
Институтом Микробиологии АН России совместно с Научно – производственным предприятием «Биотехинвест» разработан микробиологический препарат «Деворойл». Препарат предназначен для биодеградации нефти и нефтепродуктов при загрязнении почв, водоемов, поверхностей акваторий, а также внутренних поверхностей танков нефтеналивных судов и прочих резервуаров.
Микробиологический препарат «Деворойл» состоит из тщательно подобранного сообщества углеводородоокисляющих бактерий и дрожжей. В состав ассоциации входят вегетативные клетки непатогенных штаммов культур родов Rhodococcus, Pseudomonas и Yarovvia. Бактерии способны окислять нефтяные n – алканы длиной цепи С9 – С30 и ароматические углеводороды. Удачно подобранная ассоциация микроорганизмов дает препарату множество принципиальных преимуществ.
Также для ликвидации нефтяных загрязнений почвы используется препарат «Дестройл». Коммерческий препарат, выпускаемый Бердским заводом биологических препаратов, полученный на основе выделенной из природы микробной культуры Acinetobacter sp. Обладает высоковыраженной активностью в отношении углеводородов нефти и нефтепродуктов, вызывая в них глубокие необратимые процессы деградации до остаточных продуктов, относящихся к экологически нейтральным соединениям.
3.4 Трансформация нефти в почве микробиологическим препаратом и дождевыми червями
Ученые Иркутского Государственного Университета (Стом, Матвеева и др., 2006) проводили исследования. В лабораторных условиях изучали влияние дождевых червей и нефтеразрушающего микробиологического препарата, а также их бинарной смеси на образцы нефтезагрязненной почвы. Трансформация нефтяного загрязнения, снижение фитотоксичности исследуемых образцов и рекультивация почвы наиболее эффективно происходит под действием комплекса биодеструкторов.
Было предложено для элиминирования нефтегенного загрязнения совместное применение нефтеразрушающих микробиологических препаратов и дождевых червей. При использовании такого подхода предполагалось увеличение скорости и степени биотрансформации нефтепродуктов, восстановление структуры почвы, устранение необходимости дополнительной аэрации и повторного внесения препарата.
Источником микроорганизмов служил микробиологический препарат "Дестройл", рекомендованный для очистки почвы от нефти и нефтепродуктов. В качестве дождевых червей использовали красный калифорнийский гибрид дождевого червя Eisenia foetida.
Эксперименты проводили в садках размером 180 мм - 120 мм - 60 мм, помещая туда образцы нефтезагрязненной почвы (толщина слоя 50 мм). В работе использовали дерново-подзолистую почву, в которую добавляли нефть Марковского месторождения Иркутской области (из расчета 25 г нефти на 1 кг почвы). В один из опытных садков вносили микробиологический препарат "Дестройл" (0,5 г на 100 г нефтезагрязненной почвы), в другой - дождевых червей, а в третий - добавляли "Дестройл" совместно с дождевыми червями. Червей брали одинакового возраста длиной 60-70 мм по пять особей. Контролем служила нефтезагрязненная почва, в которую не добавляли ни червей, ни «Дестройл».
Количественное содержание нефти, экстрагированной хлороформом (Агранович, 1979), в процессе опыта определяли на спектрофотометре СФ - 46, при l = 286 нм (Куркова, Бриль, 1990).
Определение скорости вермитрансформации почвы червями вели по оригинальной методике (Стом и др., патент №96114221). В основе этого метода лежит регистрация толщины слоя копролитов накапливающихся на поверхности субстрата. Оценку фитотоксичности водных вытяжек из почв осуществляли по пробе на прорастание семян редиса (Stom, 1982). Подсчитывали число проросших семян и измеряли длину проростков. Каждый опыт проводили не менее чем с тремя параллелями и в 5 биологических повторностях.
Как видно из рисунка 3.1 добавление в почву червей, а еще в большей степени микробиологического препарата существенно активизировало процессы элиминирования нефти в исследуемых образцах. По мере увеличения продолжительности экспериментов наблюдали все более значительное снижение содержания нефти при совместном действии красного калифорнийского гибрида и препарата "Дестройл" по сравнению с действием биодеструкторов порознь. Особенно наглядно это проявлялось в сорокасуточных экспериментах, когда наблюдалось заметное снижение влияния отдельно внесенных дождевых червей и микробиологического препарата.