Навесні 1858 р. Казанський університет обирає Костомарова професором для викладання «русских древностей», але Міністерство народної освіти не дозволило йому посісти кафедру. Проте вже наступного, 1859 р. Санкт-Петербурзький університет запросив ученого обійняти кафедру російської історії. Там він як екстраординарний професор викладав з листопада 1859 по березень 1862 р. У своїх лекціях Костомаров висував на перший план історію народного життя в його найрізноманітніших виявах.
За поданням міністра народної освіти в січні 1860 р. Костомаров став членом Археографічної комісії в Санкт-Петербурзі, де до кінця життя готував і редагував серійне видання документів з української, російської та білоруської історії - «Акты Южной и Западной России». За редакцією Костомарова впродовж 1861-1884 рр. опубліковано 12 з 15 томів цього капітального видання, що містить унікальні матеріали із середньовічної та ранньомодерної історії, зокрема історії українського козацтва, визвольної війни на чолі з Б. Хмельницьким, матеріали біографічного характеру про найважливіших діячів тієї епохи та багато інших, що не втратили наукової цінності дотепер. Саме цей його доробок високо оцінив І. Крип'якевич, на думку якого, навіть якщо б усі монографії Костомарова втратили наукове значення внаслідок новітніх досліджень, археографічні публікації залишатимуться вічним пам'ятником його науковій сумлінності .
Наукова діяльність у царині археографії, архівознавства та джерелознавства зробила Костомарова одним із найкращих фахівців з української історії того часу, а також забезпечила джерельну основу його монографій та розвідок «Гетманство Выговского» (1861), «Гетманство Юрия Хмельницкого» (1868), «Павел Полуботок» (1876), «Руина. Историческая монографія» (1663-1687), «Гетманства Бруховецкого, Многогрешного и Самойловича» (1879— 1880), «Мазепа. Историческая монография» (1882), «Мазепинцы» (1884). Ці праці засвідчують, що вчений дотримувався сформульованого ним на початку творчої діяльності проекту систематичного вивчення і висвітлення історії України в цілому[1,94].
На початку 60-х років XIX ст. М. Костомаров проявив себе як блискучий полеміст у дискусіях з визначними науковими авторитетами (М. Погодін, С. Соловйов та ін.). За здійснений у 1861 р. критичний огляд праці І. Попки «Черноморские козаки» він одержав від Санкт-Петербурзької академії наук золоту медаль (удруге цієї нагороди його було удостоєно в 1872 р. за присудом рецензента, німецького вченого Е.А.Германа, за монографію «Последнпе годы Речи Посполитой» (1870)). Одночасно Костомаров співпрацював із провідними російськими часописами пореформеної доби - журналами «Отечественные записки» та «Современник»[1,94].
Саме тоді Санкт-Петербург, у якому мешкали Костомаров та деякі інші колишні кирило-мефодіївці, перетворився на один із центрів українського національно-культурного руху. Його ідейним рупором став часопис «Основа» (1861-1862), на сторінках якого Костомаров вів дискусії з польськими та російськими вченими, а також публікував нариси про Г. Сковороду, Т. Шевченка та інші праці. Крім того, він умістив у цьому виданні низку статей науково-публіцистичного і полемічного спрямування, присвячених переважно з'ясуванню етносоціальних та етнопсихологічних рис українського народу, зокрема особливостей його історичного буття. Серед них найбільш ґрунтовні та відомі «Мысли о федеративном начале в древней Руси» (1861) та «Две русские народности» (1861). Разом з іншими студіями вченого, такими як «Украйна» (1860), надрукована в газеті «Колокол», вони заклали основи народницько-романтичної, з елементами позитивізму, історіософії. На думку М. Драгоманова, М. Грушевського та інших учених, у згаданих студіях представлено ідеї Костомарова доби Кирило-Мефодіївським братчиків, зокрема апологію історичного буття українського народу .
У 1862 р. Костомаров був змушений перервати професорську кар'єру. Сталося це через закриття Санкт-Петербурзького університету в 1861 р. та конфлікт навколо професора П. Павлова, репресованого за читання публічної лекції у 1862 р. У читанні лекцій брав участь і Костомаров, який відмовився їх припинити на знак протесту проти арешту Павлова[2,12]. Відтак у вченого склалися напружені стосунки як з адміністрацією університету, так і з ініціаторами акцій протесту. Тому він вирішив вийти зі складу професорської корпорації і з того часу став виключно кабінетним ученим. Утім, Костомарову не раз пропонували кафедри в Київському (1862, 1863, 1868, 1869), Казанському (1865) та Харківському (1864, 1865) університетах. Проте вченому так і не вдалося поновити викладацьку діяльність у вищій школі з різних причин, зокрема через перешкоди, які чинило йому Міністерство народної освіти. Та, незважаючи на це, в 1864 р. рада Київського університету Св. Володимира присудила Костомарову ступінь доктора історії. Одночасно дослідник продовжував активну громадську та просвітницьку діяльність, зокрема проводив у себе вдома «вівторки», на яких збиралися науковці, митці, письменники, журналісти, громадські діячі й обговорювали різноманітні питання, у тому числі суспільного і політичного життя[3,9]. Відвідували «вівторки» Т. Шевченко, О. Пипін, О. Бодянський, М. Ге, Д. Мордовець, Н. Вілозерська та ін. Загалом помешкання М. Костомарова стало своєрідним клубом тогочасної інтелігенції.
У 1872 р. унаслідок напруженої роботи зір М. Костомарова настільки ослаб, що він уже не міг вести систематичних архівних пошуків. Тому вчений зосередився на створені науково-популярної праці «Русская история в жизнеописаниях ее главнейших деятелей». Вона є систематичною версією російської і почасти української історії з перспективи біографістики, і нині користується чималою популярністю. 60-70-ті роки XIX ст. Костомаров присвятив також літературній роботі. З-під його пера вийшла низка оригінальних творів, зокрема таких відомих, як «Кудеяр» (1875), «Холуй» 1878), «Черниговка» (1881), що принесли йому славу як письменнику. У 70-х роках XIX ст. наукова діяльність Костомарова здобула загальне визнання як у Російській імперії, так і за кордоном. У 1876 р. вченого обирають членом-кореспондентом Санкт-Петербурзької академії наук, а пізніше — Південнослов'янської академії та Сербського вченого товариства. У 1884 р. він став почесним членом Київського університету Св. Володимира. У 1873 і 1874 рр. у Києві проводився III Археологічний з'їзд, на якому М. Костомаров читав реферат «Об образовании княжеской дружины, о ее значении в древнєє время и о ее изменениях в последующем быте русского народа». Тут учений зустрівся зі своєю колишньою нареченою Аліною Крагельською (у шлюбі Кисіль). Взимку 1875 р. вона переїхала до Санкт-Петербурга, щоб доглядати Костомарова, і оскільки він тяжко занедужав, імовірно на тиф, і перебував у критичному і стані. 1 лютого 1875 р. померла від тифу мати Костомарова Тетяна Петрівна, яка опікувалася сином до кінця свого життя. Після одужання навесні 1875 р. М. Костомаров разом із Аліною Кисіль поїхав до України. Там, у Дідівцях - маєтку Киселів поблизу Прилук, 9 травня 1875 р. вони обвінчалися у місцевій церкві. Упродовж 1875-1881 р. Костомаров продиктував дружині спогади, в яких докладно висвітлив обставини свого життєвого і творчого шляху[2,13]. Вперше без купюр вони були опубліковані під назвою «Автобіографія» у 1922 р. в Москві. Книга являє собою не тільки власний життєпис Костомарова, а й репрезентує його бачення епохи, тогочасних політичних, громадських, наукових проблем і становить неабияку цінність для всіх, кого цікавить історія XIX ст. Небезінтересна вона і для любителів мемуаристики.
Наприкінці 70-х — на початку 80-х років XIX ст. М. Костомаров приділяє велику увагу полеміці навколо українофільства, зокрема вміщує в періодиці низку статей з цього питання: «Малорусское слово» (1881), «По поводу статьи г. Де-Пуле об украинофильстве» (1882) та ін. Розвідки Костомарова з українофільства мали поліфункціональне призначення. З одного боку, вони спрямовувалися проти панівних стереотипів і міфів російської освіченої публіки, які побутували в суспільстві після Емського акта 1876 р., а з іншого - мали практичну мету: надати українському питанню суспільного розголосу, щоб хоч якоюсь мірою послабити репресивні антиукраїнські акції російського царату. Проте українофільство Костомарова досить суперечливо сприймалося російською інтелігенцією, значна частина якої вбачала в ньому загрозу для імперського режиму або для поступу російської літератури та культури. Натомість радикально налаштованим колам українства позиція Костомарова видалася занадто ліберальною і викликала гострий осуд.
В останні роки життя у вченого значно погіршився зір. Восени 1881 р. його при переході вулиці збив вантажний візник, що стало причиною посилення кашлю й нападів задухи. У січні 1884 р., вийшовши надвечір з приміщення архіву, він був збитий з ніг і зім'ятий парою коней, запряжених у дишлові сани. Тоді з горла й вуха у нього точилася кров. З того часу, зазначає його дружина, хвороба швидше почала руйнувати міцний організм Миколи Івановича . Він практично вже не бачив на одне око і з жахом очікував повної сліпоти. Тяжка хвороба Костомарова майже повністю позбавила його можливості працювати, хоча він навіть за таких обставин диктував Аліні Леонтіївні невеликі статті й потроху писав сам, працюючи над епохою фельдмаршала В.К. Мініха, життєписом М. Ломоносова та ін.
7 квітня 1885 р. Микола Іванович Костомаров помер. Поховали його 11 квітня на Волковому кладовищі у Санкт-Петербурзі, біля Літературних мостиків. 7 квітня 1889 р. на могилі було відкрито пам'ятник (майстер К. Сетінсон) — гранітний хрест на постаменті з написом: «Николай Иванович Костомаров. 1817-1885. Историк, писатель»[2,14]. За заповітом Миколи Костомарова право на видання його творів було надано Літературному фонду; крім того, Аліна Костомарова передала у власність фонду примірники опублікованих праць чоловіка, зокрема відомий збірник «Литературное наследие Н. И. Костомарова» (1890). В 1894 р. вона також передала у власність Київському університету Св. Володимира унікальну бібліотеку вченого - 1425 книжок і 29 рукописів.