Атф индуцированное изменение внутриклеточной концентрации кальция в нейронах неокортекса крыс (стр. 2 из 6)

2.1.3 Кальциевые каналы эндоплазматического ретикулума

Са²⁺ каналы ЭР являются олигометрическими протеинами, встроенными в мембрану ЭР. Эти каналы можно относительно легко выделить из клетки для дальнейшего структурного анализа благодаря тому, что белки канала связываются специфически и с высоким сродством с IP₃ (для IP₃-управляемых каналов) и с рианодином (для Са²⁺-управляемых каналов).

Са²⁺-управляемые Са²⁺ каналы ЭР. Эти кальциевые каналы были впервые выделены из скелетных и сердечных мышц. Оказалось, что Са²⁺ каналы ЭР в этих мышечных тканях имеют молекулярные различия и закодированы различными генами. Са²⁺ каналы ЭР в сердечных мышцах непосредственно связаны с высокопороговыми Са²⁺ каналами плазмалеммы (L-тип) через кальцийсвязывающие белки, образуя, таким образом, функционально активную структуру - «триаду». В скелетных мышцах деполяризация плазмалеммы прямо активирует освобождение Са²⁺ из саркоплазматического ретикулума благодаря тому, что Са²⁺ каналы плазмалеммы служат потенциал - чувствительными передатчиками активирующего сигнала непосредственно Са²⁺ каналам ЭР через связывающие белки (44). Таким образом, Са²⁺ депо скелетных мышц обладают механизмом освобождения Са²⁺, вызываемым деполяризацией (RyR1-тип). В отличие от скелетных мышц, саркоплазматические Са²⁺ каналы кардиомиоцитов не связаны с плазмалеммой, и для стимуляции освобождения Са²⁺ из депо требуется увеличение концентрации цитозольного кальция (RyR2-тип). ДНК, кодирующая белки двух типов каналов Са²⁺ освобождения, была клонирована из тканей человека и кролика, что дало возможность экспрессировать Са²⁺-управляемые Са²⁺ каналы в модельные клеточные системы. Белки, встроенные в липидный бислой, формируют чувствительные к рианодину каналы, активируемые ионами Са²⁺ (50 нмоль/л) в присутствии АТФ (29). Кроме этих двух типов Са²⁺-активируемых Са²⁺ каналов, недавно был идентифицирован третий тип Са²⁺ каналов ЭР (RyR3-тип), который является продуктом другого гена. Этот третий тип Са²⁺ каналов ЭР, как было показано, не чувствителен к кофеину (21). Эксперименты, проведенные на нервных тканях, продемонстрировали присутствие всех трех типов Са²⁺-управляемых Са²⁺ каналов ЭР в мозге млекопитающих, однако RyR2-тип является доминантным (38). Са²⁺-управляемые Са²⁺ каналы ЭР являются гомотетрамерами, состоящими из мономеров с молекулярным весом 500 КД (39)

IP₃-управляемые Са²⁺ каналы ЭР. Существование IP₃-управляемых Са²⁺ каналов впервые было обнаружено в нейронах Пуркинье. Позже было показано, что они встроены в мембрану эндоплазматического ретикулума. Структура IP₃-управляемых Са²⁺ каналов сходна со структурой Са²⁺-управляемых Са²⁺ каналов ЭР. Они также являются гомотетрамерами с молекулярным весом мономера 260 КД. 50% этих каналов активируется 15 мкмоль/л IP₃ и блокируется рутением красным и La³⁺. IP₃-управляемые Са²⁺ каналы были выделены из мозга млекопитающих, и их аминокислотная последовательность была расшифрована. Было показано, что семейство генов, экспрессирующих IP₃-управляемые Са²⁺ каналы, состоит из трех или четырех различных генов; они характеризуются различной чувствительностью к IP₃ и по-разному распределены в мозге млекопитающих (45). Порог активации этих каналов варьирует между 0.2 - 0.5 мкмоль/л в нейронах Пуркинье мозжечка и возрастает до 9 мкмоль/л в астроцитах.

2.1.4 Кальциевые насосы

Существует два семейства Са²⁺ насосов, ответственных за устранение ионов Са²⁺ из цитоплазмы: Са²⁺ насосы плазмалеммы и Са²⁺ насосы эндоплазматического ретикулума. Хотя они относятся к одному семейству белков (так называемому P-классу АТФ-аз), эти насосы обнаруживают некоторые различия в строении, функциональной активности и фармакологии.

Кальциевый насос плазмалеммы. Са²⁺ насос плазмалеммы, который удаляет ионы Са²⁺ из цитоплазмы в межклеточное пространство, был открыт в 1966 году. Молекулярные свойства Са²⁺ насосов плазмалеммы описаны в нескольких обзорах (18), однако достоверных данных о скорости вывода Са²⁺ и регуляции Са²⁺ насосов в нервных клетках немного. Недавно был разработан двухфлуоресцентный микрокапельный метод (58), позволяющий одновременно измерять [Ca²⁺]_i и выход Са²⁺ наружу на одиночных клетках. Исследования, проведенные с помощью данного метода на нейронах моллюска и секреторных клетках, показали, что активность Са²⁺ насоса плазмалеммы контролируется непосредственно [Ca²⁺]_i: увеличение концентрации цитоплазматического кальция активирует Са²⁺ насос (58). В нейронах моллюска около 40% ионов кальция, входящих в клетку в ответ на деполяризацию мембраны, выводится из нейрона уже во время фазы нарастания [Ca²⁺]_i, отражая таким образом активацию кальциевого насоса плазмалеммы увеличением концентрации цитозольного Са²⁺ (58).

Кальциевый насос эндоплазматического ретикулума. Во многих эукариотических клетках, наряду с Са²⁺ насосом плазмалеммы, существует кальциевый насос сарко(эндо)плазматического ретикулума (SERCA). В настоящее время описано по крайней мере 3 различных изоформы SERCA-насосов в клетках млекопитающих. SERCA1-подтип сосредоточен исключительно в быстрых скелетных мышцах, SERCA2-насосы широко распространены в других тканях. Значимость SERCA3-насосов менее ясна (13). Белки SERCA2-насосов разделяются на две различные изоформы: SERCA2а, характерные для кардиомиоцитов и гладких мышц, и SERCA2b, характерные для тканей мозга. Предполагается, что насосы SERCA различными способами регулируются цитоплазматической и интралюминальной концентрациями Са²⁺: Увеличение [Ca²⁺]_i активирует захват ионов кальция в ЭР, в то время как увеличение свободного кальция внутри ЭР ингибирует насосы SERCA (12). Насосы SERCA эффективно и селективно блокируются тапсигаргином в наномолярных концентрациях (37) и микромолярными концентрациями циклопиазоновой кислоты. Однако, тапсигаргин вызывает также блокаду потенциал - управляемых кальциевых каналов плазмалеммы, как это показано на клетках коркового слоя надпочечников и на сенсорных нейронах (Shmigol et al., 1995), поэтому его следует использовать с некоторой осторожностью.

2.1.5 Кальциевые обменники

Дополнительным механизмом, ответственным за вывод ионов кальция из цитоплазмы, является натрий-кальциевый обменник, который выводит Са²⁺, используя энергию натриевого электрохимического градиента. Наличие Na⁺- Са²⁺ обменника было показано в различных типах возбудимых и невозбудимых клеток; в клетках нервной системы он был обнаружен в конце 60-х годов (9). В нейронах моллюска, помещенных в среду с пониженным натрием (т.е. с обратным натриевым градиентом), наблюдалось увеличение [Ca²⁺]_i, что является результатом работы обменника в инвертированной форме. Однако, вклад Na⁺- Са²⁺ обменника в регуляцию [Ca²⁺]_i в нейронах млекопитающих до сих пор не оценен. В некоторых работах было показано, что обменник принимает незначительное участие в удалении цитоплазматического Са²⁺, в то время как в других работах представлены данные о том, что обменник играет существенную роль в переносе Са²⁺ через мембрану (57).

2.1.6 Са²⁺-связывающие органеллы

Кроме быстрого связывания цитозольного Са²⁺ внутриклеточными Са²⁺-связывающими белками, ионы кальция, попадающие в цитозоль, могут аккумулироваться аппаратом Гольджи или клеточным ядром, захватываться митохондриальными Са²⁺ депо, имеющими достаточно невысокое сродство к Са²⁺, или быстрыми депо, связанными с ЭР или СР, имеющими высокое сродство к Са²⁺. Однако если [Ca²⁺]_i превышает 0,5 мкмоль/л, наблюдается существенное перераспределение [Ca²⁺]_i в область митохондрий. Буферные системы митохондрий принимают участие в удалении избыточного Са²⁺ из цитоплазмы в клетках кишечника, некоторых типах нервных клеток (59) и в секреторных клетках после повышения [Ca²⁺]_i, стимулированного агонистами. Связывание кальция митохондриями обеспечивается активностью систем, расположенных на внутренней митохондриальной мембране. Са²⁺ поступает в митохондрии по электрохимическому градиенту; разность потенциалов, обеспечивающая транспорт кальция, создается переносом электронов во время клеточного дыхания и связанного с ним переносом протонов. Перенос электронов по дыхательной цепи является основным механизмом, обеспечивающим энергетику транспорта кальция. Подавление дыхательной цепи карбонил-цианид-м-хлорофенил-гидразоном (СССР) эффективно блокирует аккумуляцию кальция митохондриями (41).

2.2 Влияние АТФ на кальциевый гомеостаз

Последние исследования показали, что АТФ занимает прочное место в ряду нейромедиаторов центральной и периферической нервной систем (Burnstock 1990). Не вызывает сомнения, что АТФ является не только важнейшим внутриклеточным метаболитом, но и служит важным объектом межклеточного взаимодействия.

2.2.1 Строение и свойства АТФ

АТФ (см. рис.1) представляет собой нуклеотид и как всякий нуклеотид состоит из трех компонентов: азотистого основания, сахара пентозы и фосфата. В качестве азотистого основания в нуклеотидах присутствуют производные пурина и пиримидина. Фосфаты соединены в полифосфатную цепь, количество которых в естественных нуклеотидах не превышает трех. Однако синтезированы нуклеотиды, содержащие линейные цепи из более чем 3-х фосфатов, к примеру аденозинтетра- и аденозинпентафосфаты.