МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО И СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИИ
МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ФИЗИКО-ТЕХНИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
ДИПЛОМНАџЯ РАБОТА
АТФ индуцированное изменение внутриклетоЧной концентрации кальцияЯ в нейронах неокортекса крыс.
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ академик Магура И.С.
КОНСУЛЬТАНТ к. б. н. Войтенко Н.В.
рецензент к.б.н. Исаев Д
ДИПЛОМНИК кругликов И.А.
Москва 1998
Оглавление
1. ÂÂÅÄÅÍÈÅ.......................................................................................................................... 4
2. ÎÁÇÎÐ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ....................................................................................................... 5
2.1 Ãîìåîñòàç êàëüöèßÿ â íåðâíûõ êëåòêàõ............................................................... 5
2.1.1 Êàëüöèåâûå êàíàëû ïëàçìàòè÷åñêîé ìåìáðàíû.................................................... 5
2.1.2 Êàëüöèåâûå áóôåðû............................................................................................... 7
2.1.3 Êàëüöèåâûå êàíàëû ýíäîïëàçìàòè÷åñêîãî ðåòèêóëóìà...................................... 8
2.1.4 Êàëüöèåâûå íàñîñû............................................................................................... 11
2.1.5 Êàëüöèåâûå îáìåííèêè........................................................................................... 13
2.1.6 Ñà2+-ñâÿçûâàþùèå îðãàíåëëû............................................................................. 13
2.2 Вëèßÿíèå ÀÒÔ íà êàëüöèåâûé ãîìåîñòàç........................................................... 14
2.2.1 Ñòðîåíèå è ñâîéñòâà ÀÒÔ................................................................................... 15
2.2.2 Íîìåíêëàòóðà è ñóáêëàññèôèêàöèÿ ïóðèíîðåöåïòîðîâ...................................... 16
2.2.3 Ð1 ïóðèíîðåöåïòîðû............................................................................................... 16
2.2.4 Ð2 ïóðèíîðåöåïòîðû............................................................................................... 17
2.2.5 Ðåêëàññèôèêàöèÿ ïóðèíîðåöåïòîðîâ.................................................................. 20
3. ÎÁÚÅÊÒ È ÌÅÒÎÄÛ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÉ........................................................................... 21
3.1 Ïîäãîòîâêà ïðåïàðàòà............................................................................................... 21
3.2 Õàðàêòåðèñòèêè êàëüöèåâîãî çîíäà.................................................................. 22
3.3 Îêðàñêà ñðåçîâ ôëóîðåñöåíòíûì êðàñèòåëåì................................................... 24
3.4 Ñòðóêòóðà ýêñïåðèìåíòàëüíîé óñòàíîâêè äëÿß äâóõ-âîëíîâîãî èçìåðåíèÿ êîíöåíòðàöèè êàëüöèÿß............................................................................................................................ 24
3.5 Ðàñòâîðû è ñìåíà ðàñòâîðîâ.................................................................................. 27
4. ÐÅÇÓËÜÒÀÒÛ ÈÑÑËÅÄÎÂÀÍÈÉ................................................................................. 28
5. ÎÁÑÓÆÄÅÍÈÅ................................................................................................................... 39
6. ÂÛÂÎÄÛ............................................................................................................................. 41
7. ÑÏÈÑÎÊ ËÈÒÅÐÀÒÓÐÛ.................................................................................................. 42
Молекула АТФ давно известна как повсеместно распространенный источник энергии для внутриклеточного метаболизма. Но ее свойства как нейротрансмитера были обнаружены сравнительно недавно. Сегодня уже не осталось никаких сомнений, что АТФ является нейротрансмитером в автономных нейромышечных соединениях, ганглиях и центральной нервной системе. К примеру, было показано, что АТФ вовлечена в генерацию болевых сигналов через Р2Х1 и Р2Х2 рецепторы. Однако роль и распределение пуринорецепторов в коре головного мозга и особенно в моторной коре до сих пор остается слабо изученной. Поэтому изучение механизмов действия АТФ в коре головного мозга представляет несомненный интерес. Мы изучали действие АТФ посредством измерения концентрации внутриклеточного кальция, - одного из найболее важных и универсальных регуляторов клеточных функций.
Цель работы состояла в изучении механизмов генерации АТФ - индуцированных внутриклеточных кальциевых сигналов в нервных клетках моторной коры.
Концентрация цитозольного кальция в эукариотических клетках регулируется трансмембранным транспортом и цитоплазматическим связыванием кальция. Движение ионов кальция через мембрану контролируется: 1) двумя семействами Са2+ каналов, как то: кальциевыми каналами плазмалеммы и кальциевыми каналами, расположенными в мембране эндо(сарко)плазматического ретикулума (ЭР или СР), которые формируют пути входа кальция в цитоплазму; 2) выводом кальция из цитоплазмы благодаря активности кальциевых насосов плазмалеммы и/или кальциевых обменников; и 3) аккумуляцией ионов кальция внутриклеточными кальциевыми депо и митохондриями. Последние служат системами кальциевого буфера, способными аккумулировать и накапливать ионы кальция, поддерживая таким образом гомеостаз кальция в цитоплазме.
Нервные клетки экспрессируют различные типы кальциевых каналов плазмалеммы, которые могут быть активированы различными воздействиями. Основываясь на механизмы активации, кальциевые каналы могут быть разделены на несколько типов потенциал - управляемых и рецептор - управляемых каналов.
Потенциал - управляемые каналы вносят существенный вклад как в регуляцию входа кальция в цитоплазму, так и в нейрональный электрогенез. Белки, образующие кальциевые каналы, состоят из 5 субъедениц (a1, a2, b, g, d). Главная субъеденица a1 формирует собственно канал и содержит места связывания для различных модуляторов кальциевых каналов. Было обнаружено несколько структурно различных a1 субъедениц кальциевых каналов в нервных клетках млекопитающих (обозначенных как A, B, C, D и E). Функционально кальциевые каналы различных типов отличаются друг от друга активацией, кинетикой, проводимостью одиночного канала и фармакологией. В нервных клетках описано до 6 типов потенциал - управляемых кальциевых каналов (T-, L-, N-, P-, Q-, R- каналы). Активность потенциал - управляемых каналов плазмалеммы регулируется различными внутриклеточными вторичными посредниками и мембраносвязанными G-белками (33,26).
Второй важный путь потока ионов кальция через мембрану связан с активацией агонист - управляемых каналов. Многие агонист - управляемые каналы обладают значительной кальциевой проницаемостью при физиологических условиях. Такую кальциевую проницаемость обнаруживают нейрональные ацетилхолин(Ach)-управляемые, глутамат -управляемые (NMDA и AMPA/Каинат типы) и пуринорецепторы (10,18,49,34). Кроме кальциевых каналов плазмалеммы, управляемых внешними воздействиями, в эукариотических клетках было открыто также несколько типов кальциевых каналов, контролируемых внутриклеточными вторичными посредниками. В частности, IP3-управляемые кальциевые каналы были обнаружены в нейронах Пуркинье мозжечка (34), а IP4-управляемые кальциевые каналы - в клетках эндотелия (35).
Третий, недавно обнаруженный, особый тип Са2+ каналов, который контролируется заполненностью внутриклеточных кальциевых депо, осуществляя таким образом прямую связь между освобождением Са2+ в цитоплазму из депо и вход в нее Са2+ через плазмалемму.
Большая часть ионов Са2+, входящих в клетку, практически немедленно связывается цитоплазматическими местами связывания кальция. Показано, что только менее 1% ионов кальция, которые проникают в цитозоль, остается в несвязанном состоянии (11). Цитозольные кальциевые буферы представлены главным образом Са2+-связывающими белками, такими как парвальбумин, кальмодулин, тропонин-С, кальретинин, кальциунеурин, белок S-100 (25). Кроме того, цитозольная буферная емкость может быть опосредована АТФ, которая способна связывать значительное количество Са2+ (64). 20-50% цитозольных кальциевых буферов могут быть удалены из цитоплазмы при перфузировании клетки, что показывает их мобильность, в то время как оставшаяся часть Са2+-связывающей емкости относится к фиксированным буферам. Мобильные кальциевые буферы могут играть важную функциональную роль, способствуя диффузии ионов Са2+ в цитоплазме и распространению Са2+ сигнала по клетке. Внутриклеточное введение эндогенных Са2+ буферов (кальбиндина D28k и парвальбумина) через микропипетку приводило к увеличению скорости нарастания [Ca2+]i на несколько порядков и существенно влияло на кинетику изменения [Ca2+]i, что подтверждает роль мобильных Са2+ буферов с низким молекулярным весом в эффективном регулировании внутриклеточной концентрации кальция.