1.2.2 Структура HBsAg.
Это сложный антигенный комплекс. В этих частицах может определятся пять антигенных детерминант.
Группоспецифическая детерминанта а – общая для всех препаратов HBsAg. Еще есть две пары подтиповых детерминант: d или y, или w, или r – взаимоисключающие друг друга. Описаны антигенная гетерогенность w – детерминант и добавочные детерминанты, такие как q или x или g [15,7]. Идентифицировано 8 подтипов HBsAg: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adr [11]. Необычные комбинации подтипов детерминант выделяются на Дальнем Востоке. Наблюдается неравномерное географическое распределение подтипов HBsAg среди зараженного населения. В Северной Америке, Европе и Африке преобладают подтипы adw и ayw, а в Юго – Восточной Азии и на Дальнем Востоке – подтип adr на ряду с adw и ayw. Подтип ayr менее распространен в мире, но он идентифицирован у нескольких изолированных групп населения Океании [15,3].
Доказано, что вирус – специфическим антигеном является HBsAg, иммунизация которым обеспечивает защиту от HBV.
Для определения х/с HBsAg сферические нитевидные частицы можно очистить гельфильтарцией, скоростным зональным центрифугированием в градиенте плотности CsCl. При центрифугировании в градиенте плотности CsCl эти частицы отделяются от вируса благодаря различиям в их плавучих плотностях. Плавучая плотность (22 нм) – сферических частиц подтипов adw и ayw равна 1,20 г/см3 в CsCl и 1,17 г/см3 в сахарозе. Это свидетельствует о значительном содержании в них липидов приблизительно 30%. Более высокая плавучая плотность полных вирионов приблизительно 1,28 г/см3 для вирионов с нуклеокапсидом, содержащем ДНК и 1,24 г/см3 для вирионов с пустой сердцевиной, отражает вклад нуклеиновой кислоты в нуклеокапсиды. Липидный анализ дает смесь липидов[5,7,3,15].
Средняя молекулярная масса HBsAg / adw равна 3,7*106 - 4,6*106. при изоэлектрическом фокусировании препаратов (22 нм) – частиц HBsAg выявляется несколько популяций с различными значениями pI от 3,65 до 5,3. Средний коэффициент сидиментации для HBsAg варьирует от 39 S до 54 S. Определение среднего удельного коэффициента экстинкции 1% р-ра очищенного белка HBsAg при 280 нм лежит в пределах от 37,3 до 60,0 [13].
Методом электорофореза в ДСН – ПААГ в очищенных препаратах (22 нм) – частиц HBsAg adw - , ayw – и adr – подтипов выделено 7 или более полипептидов с молекулярной массой от 25000 до 100000. В связи с тем, что наружная оболочка вирионов HBV содержит HBsAg и липиды (частично взятые у клетки хозяина), предположили, что она химически похожа на 22 нм частицу HBsAg [5,7,15].
1.2.3 Структура вирусных нуклеокапсидов.
Сердцевина вириона несет сердцевинный антиген HBV (HBcAg), который обнаружен в крови, как внутренний компонент вириона. Он иногда определяется в сыворотке в ранний период виремии до появления антител к HBсAg. Исследования показали, что значительная фракция HBсAg – частиц, выделенных из вирионов и меньшая фракция их выделенная из зараженной печени, имеет высокую плавучую плотность в CsCl (1,38 г/см3) и содержит ДНК и ДНК - полимеразную активность [1,13,15]. Установлено, что высокоочищенные сердцевины, полученные из вирионов и HBсAg – частицы, выделенные из печени, содержат несколько уникальных полипептидов от 19 к до 38 к. Полипептид 19 к может реагировать с антителами е – антигену HBV (анти - HBe) [14,15].
1.2.3.1 Природа HBeAg
Идентифицирован в 1972 году; физически и антигенно отличается от HBsAg и HBсAg, трудно поддается очистке, представляет собой комплекс антигенов. В огаровом геле дается до 3 линий преципитации: е1, е2, е3. в сыворотках больных HBV определяются как связывающийся с (IgG) HBсAg с молекулярной массой 300 к, так и меньший «свободный» HBeAg с молекулярной массой 30 – 35 к. Свободная форма способна к диссоциации на меньшие полипептиды с молекулярной массой 15,5 к. Особо следует отметить, выраженную корреляцию присутствия HBeAg в сыворотке больных с высокой концентрацией физических вирусных частиц. Есть данные, что HBeAg и вирионы продуцируются вместе во время инфекции, кроме этого известно, что HBeAg является компонентом вириона, из которой активно высвобождается при разрушении ее детергентом [5,15].
Информация об HBeAg заложена в С – гене. Многочисленные факты, полученные при изучении HBV позволили сделать вывод о связи HBeAg с инфекционностью и наличием вируса. Оказалось, что инфекционность сывороток крови с HBeAg в миллион раз выше, чем с анти – Hbe. Однако, эта связь не абсолютна. Выявлены мутантные формы HBV, при которых блокируется синтез HBeAg. При этом, не смотря на наличие анти – Hbe в сыворотке крови удается тестировать ДНК – HBV. Исследования последних лет, связанные с изучением мутантных форм HBV, позволили по-новому взглянуть на значение HBeAg в патогенезе HBV. Предполагают, что у матерей носителей HBV HBeAg, проходя через плаценту, вызывает развитие иммунной толерантности, приводящей к прогрессированию в хронический гепатит [7,15].
1.2.3.2 Роль HBxAg
Считают, что х – антиген является как регуляторным белком, усиливающим синтез вирусных белков, так и возможно, белком, включенным в структуру HBV. HBxAg играет особую роль в развитии первичной гепатоклеточной карциномы. Р – ген, ДНК – полимеразы - фермент, информация о котором заложена в ДНК HBV. Он обладает ферментативной активностью как РНК – зависимая ДНК – полимераза и необходим для достройки внутренней короткой цепи ДНК HBV в процессе ее репликации [13,15].
1.2.4 Физическая и генетическая структура вирусной ДНК.
Вирионы HBV имеют маленькую кольцевую, частично двухцепочечную молекулу ДНК. Одноцепочечные участки варьируют по длине, составляя в различных молекулах от ~ 15 до 60%. Таким образом, ДНК состоит из длинной цепи L постоянной длины (~ 3220 оснований) во всех молекулах и короткой (S), которая в различных молекулах варьирует по длине от 1700 до 2800 оснований. ДНК полимеразы достраивает одноцепочечные участки вирусной ДНК до полностью двухцепочечной молекулы, содержащей приблизительно 3200 bр. Синтез ДНК начинается на 3' конце короткой цепи, которая в разных молекулах находится на различных участках в пределах специфической области ДНК и заканчивается по достижении 5' конца короткой цепи, расположенного в строго определенной месте. Длинная цепь не является замкнутой окружностью: в точке, расположенной приблизительно на расстоянии 300 bp от 5' конца короткой цепи, существует разрыв. С помощью нагревания при определенных условиях, которая вызывает избирательную денатурацию 300 – нуклеотидной области между 5' концом короткой цепи и разрывом длинной цепи, кольцевая ДНК может быть превращена в линейную форму с одноцепочечными липкими концами. Линейная форма может быть вновь переведена в кольцевую путем реассоциации комплементарных одноцепочечных концов. По видимому, 5' концы обеих, как длиной, так и короткой цепей ДНК HBV блокированы таким образом, что предотвращено их фосфорилирование полинуклеотиназой. Химическая природа цепи ДНК, выделенной из вирионов ковалентно присоединена к полипептиду, что предотвращает ее фосфорилирование [7,15].
1.2.5 Механизм репликации вирусов.
После проникновения вируса в клетки печени в клеточных ядрах формируются замкнутые кольцевые вирусные ДНК, состоящие из 3200 bp. Они могут функционировать как матрицы для синтеза вирусной мРНК и синтеза плюс РНК полной длины, новосинтезированная вирусная ДНК – полимераза и белок – затравка для синтеза минус – цепи ДНК собираются в комплекс с мажорным структурным полипептидом в сердцевины вируса и образуют сердцевину или нуклеокапсид вируса. Затем внутри нуклеокапсида синтезируется минус – цепь вирусной ДНК. В этом процессе используется белковая затравка и РНК матрица, которая по мере синтеза ДНК деградирует под действием РНК азы Н. на матрице минус – цепи ДНК кольцевой конформации синтезируется плюс – цепь вирусной ДНК. Затем частицы сердцевины собираются в полные вирионы с HBcAg и липидосодержащими оболочками клеточной мембраны. В случае HBV формирование вируса и выделение его из клетки могут, происходить, очевидно, на любой ступени после сборки сердцевины, так как вирионы (частицы Дейна) содержащие молекулы гибридов ДНК – РНК, а также частично одноцепочечные кольцевые ДНК обнаруживаются в крови. Эндогенное ДНК полимеразы в вирионах катализируют включение нуклеотидов в минус – цепи ДНК гибридов РНК – ДНК и в плюс - цепи ДНК частично одноцепочечных молекул [15].
1.2.6 Чувствительность HBV к физико – химическим факторам.
Характеризуется значительной устойчивостью, при t = -20Со сохраняется до 20 лет, не инактивируется при замораживании – оттаивании, сохраняется при 56 Со около суток, а при 60 Со – 30 минут. Антиген устойчив к воздействию протеолитических ферментов и органических растворителей. Под действием эфира, хлороформа, 1,5% формалина, 2% р-ра фенола не инактивируется несколько часов. При t = 100 Со надо несколько минут, чтобы убить вирус. В сыворотке сохраняется 6 месяцев при 30 – 32 Со. после высушивания вирус сохраняет жизнеспособность при 25 Со около недели. При процедуре фракционирования плазмы по Кону, большая часть HBV, HBeAg, ДНК – полимеразы сохраняется в первой фракции (фибриноген, фактор - восемь) или во фракции три (протромбиновый комплекс), тогда как большая часть HBsAg перемещается во фракцию четыре (плазматических белков), а меньшее количество во фракции три и пять (альбумин). После прогревания HBV до 60Со в течении 4 часов вирус не инактивируется, 10 часов при 60 Со ликвидирует его. При 98 Со инфекционность сыворотки частично устраняется через 1 минуту или полностью через 20 минут. Сухой жар 160 Со разрушает инфекционность через час. В другой серии опытов HBV в течении 10 минут обрабатывали при 20 Со одним из пяти дезинфицирующих препаратов (гепатохлоридом натрия + 500 мг свободного активного хлора на 1 литр; Cidex СХ – 250 + 2% водный р-р глутаральдегида, рН – 8,4; Sporicidin рН – 7,9 + 0,12% - ный глутаральдегид и 0,44% - ный фенол; 70% - ным изопропиловым спиртом; Weskodine, разведенным 1:213 и содержащим 80 мг активного йода на 1 литр) и затем вводили одному шимпанзе. Ни у одного из пяти не было отмечено признаков заболевания. На конец отмечено, что обработка вета – пропилактоном + УФ – лучами уменьшает титр HBV в плазме приблизительно в 10 млн. раз [14,15].