Энергия, высвобождаемая в процессе переноса электронов по дыхательной цепи, запасается в форме электрохимического протонного градиента на внутренней мембране митохондрий.
Окислительное фосфорилирование возможно благодаря тесной ассоциации переносчиков электронов с белковыми молекулами. Белки направляют электроны по дыхательной цепи так, что они последовательно переходят от одного ферментного комплекса к другому, не «перескакивая» через промежуточные звенья. Особенно важно то, что перенос электронов сопряжен с аллостерическими изменениями определенных белков молекул, в pезультате чего энергетически выгодный поток электронов вызывает перекачивание протонов (Н+) через внутреннюю мем6рану из матрикса в межмембранное пространство и далее за пределы митохондрии. Передвижение протонов приводит к двум важным следствиям: 1) между двумя сторонами внутренней мембраны создается градиент рН - в матриксе рН выше, чём в цитозоле, где значение рН обычно близко к 7,0 (так как малые молекулы свободно проходят через наружную мембрану митохондрии, рН в межмембранном пространстве будет таким же как в цитозоле); 2) на внутренней мембране создается градиент напряжения (мембранный потенциал), причем внутренняя сторона мембраны заряжается отрицательно, а наружная - положительно. Градиент рН (DрН) заставляет ионы Н+ переходить обратно в матрикс, а ионы ОН- из матрикса, что усиливает эффект мембранного потенциала, под действием которого любой положительный заряд притягивается в матрикс, а любой отрицательный выталкивается из него. Совместное действие этих двух сил приводит к возникновению электрохимического протонного градиента. Электорохимический протонный градиент создает протонодвижущую силу, измеряемую в милливольтах (мВ).
Энергия электрохимического протонного градиента используется для синтеза АТФ и транспорта метаболитов и неорганических ионов в матрикс.
Внутренняя мембрана митохондрий отличается необычно высоким содержанием белка - в ней по весу примерно 70% белка и 30%фосфолипидов. Многие из этих белков входят в состав электронтранспортной цепи, поддерживающей протонный градиент на мембране. Другой важный компонент - фермент АТФ-синтетаза, катализирующий синтез АТФ. Это большой белковый комплекс, через который протоны перетекают обратно в матрикс по электрохимическому градиенту. Подобно турбине, АТФ-синтетаза преобразует одну форму энергии в другую, синтезируя АТФ из AДФ и Фн в митохондриальном матриксе в ходе реакции, сопряжённой с током протонов в матрикс (см. рисунок 3).
Рисунок 3. Общий механизм окислительного фосфорилирования.[1,1994]
Но синтез АТФ - это не единственный процесс, идущий за счет энергии электрохимического градиента. В матриксе, где находятся ферменты, участвующие в цикле лимонной кислоты и других метаболических реакциях, необходимо поддерживать высокие концентрации различных субстратов; в частности, для АТФ-синтетазы требуются AДФ и фосфат. Поэтому через внутреннюю мембрану должны транспортироваться разнообразные несущие заряд субстраты. Это достигается с помощью различных белков-переносчиков, встроенных в мембрану, многие из которых активно перекачивают определенные молекулы против их электрохимических градиентов, т.е. осуществляют процесс, требующий затраты энергии. Для большей части метаболитов источником этой энергии, служит сопряжение с перемещением каких-то других молекул «вниз» по их электрохимическому градиенту. Например, в транспорте АДФ участвует система антипорта АДФ-АТФ: при переходе каждой молекулы AДФ в матрикс из него выходит по своему электрохимическому градиенту одна молекула АТФ. В то же время система симпорта сопрягает переход фосфата внутрь митохондрии с направленным туда же потоком Н+: протоны входят в матрикс по своему градиенту и при этом “тащат” за собой фосфат. Подобны образом переносится в матрикс и пируват. Энергия электрохимического протонного градиента используется также для переноса в матрикс ионов Са2+ , которые, по-видимому, играют важную роль в регуляции активности некоторых митохондриальных ферментов.
Чем больше энергии электрохимического градиента затрачивается на перенос молекул и ионов в митохондрию, тем меньше остается для синтеза АТФ. Например, если изолированные митохондрии поместить в среду с высоким содержанием Са2+ , то они полностью прекратят синтез АТФ; вся энергия градиента будет расходоваться на транспорт Ca2+ в матьрикс. В некоторых специализированных клетках электрохимический протонный градиент «шунтируется» таким образом, что митохондрии вместо синтеза АТФ образуют тепло. Очевидно, клетки способны регулировать использование энергии электрохимического протонного градиента и направлять ее на те процессы, которые наиболее важны в данный момент.
В процессе окислительного фосфорилирования каждая пара электронов НАДH обеспечивает энергией образование примерно трех молекул АТФ. Пара электронов ФАДH2, обладающая меньшей энергией, дает энергию для синтеза только двух молекул АТФ. В среднем каждая молекула ацетил-СоА поступающая в цикл лимонной кислоты, дает около 12 молекул АТФ. Это означает, что при окислении одной молекулы глюкозы образуются 24 молекулы АТФ, а при окислении одной молекулы пальмитата - жирной кислоты с 16 углеродными атомами - 96 молекул АТФ. Если учесть также экзотермические реакции, предшествующие образованию ацетил-СоА, окажется, что полное окисление одной молекулы глюкозы дает около 36 молекул АТФ, тогда как при полном окислении пальмитата образуется примерно 129 молекул АТФ. Это максимальные величины, так как фактически количество синтезируемого в митохондриях АТФ зависит от того, какая доля энергии протонного градиента идет на синтез АТФ, а не на другие процессы. Если сравнитъ изменение свободной энергии при сгорании жиров и углеводов прямо до СО2 и Н2О с общим количеством энергии, запасаемой в фосфатных связях АТРФ в процессах биологического окисления, окажется, что эффективность преобразования, энергии окисления в энергию АТФ часто превышает 50%. Поскольку вся неиспользованная энергия высвобождается в виде тепла, крупные организмы нуждались бы в более эффективных способах отвода тепла в окружающую среду.
Огромное количество свободной энергии, высвобождаемое при окислении, может эффективно использоваться только мелкими порциями. В сложном процессе окисления участвует много промежуточных продуктов, каждый из которых лишь незначительно отличается от предыдущего. Благодаря этому высвобождаемая энергия дробится на меньшие количества, которые можно эффективно преобразовывать с помощью сопряженных реакций в высокоэнергетические связи молекул АТФ и НАДH .
В 1960 г. было впервые показано, что различные мембранные белки, участвующие в окислительном фосфорилировании, могут быть выделены без потери активности. От поверхности субмитохондриальных частиц удалось отделить и перевести в растворимую форму усеивающие их крошечные белковые структуры. Хотя субмитохондриальные частицы без этих сферических структур продолжали окислять НАДH в присутствии кислорода, синтеза АТФ при этом не происходило. С другой стороны, выделенные структуры действовали как АТФазы, гидролизуя АТФ до АДФ и Фн. Когда сферические структуры (названные F1-АТФазами) добавляли к лишенным их субмитохондриальным частицам, реконструированные частицы вновь синтезировали АТФ из AДФ и Фн.
F1- АТФаза - это часть большого, пронизывающего всю толщу мембраны комплекса, который состоит по меньшей мере из девяти различных полипептидных цепей. Этот комплекс получил название АТФ-синтетаза; он составляет около 15% всего белка внутренне митохондриальнои мембраны. Весьма сходные АТФ-синтетазы имеются в мембранах хлоропластов и бактерий. Такой белковый комплекс содержит трансмембранные каналы для протонов, и происходит только тогда, когда через эти каналы проходят протоны вниз по своему электрохимическому градиенту.
АТФ-синтетаза получила свое название в связи с тем, что в обычных условиях npoтоннoro градиента, поддерживаемого дыхательной цепью, синтезирует большую часть всего АТФ клетки. Число протонов, необходимое для синтеза одной молекулы АТФ, в точности не известно. При прохождении через АТФ-синтетазу протонов синтезируется одна молекула АТФ.