Для работы энергопреобразующего механизма, лежащего в основе окислительного фосфорилирования, нужно, чтобы каждый ферментный комплекс дыхательной цепи был ориентирован во внутренней митохондриальной мембране определенным образом – так, чтобы все протоны перемещались в одном направлении, т. е. из матрикса наружу. Такая векторная организация мембранных белков была продемонстрирована с помощью специальных зондов, не проходящих сквозь мембрану, которыми метили комплекс только с какой-нибудь одной стороны мембраны. Специфическая ориентация в бислоe свойственна всем мембранным белкам и очень важна для их функции.
Механизмы перекачивания протонов компонентами дыхательной цепи.
В процессе окислительного фосфорилирования при окислении одной молекулы НАДН (т.е. при прохождений двух электронов через все три ферментных комплекса) образуется не более трех молекул АТФ. Если предположить, что обратное прохождение трех протонов через АТФ-синтетазу обеспечивает синтез одной молекулы АТФ, можно будет заключить, что в среднем перенос одного электрона каждым комплексом сопровождается перемещением полутора протонов (иными словами, при транспорте одного электрона некоторые комплексы перекачивают один протон, а другие - два протона). Вероятно, у разных компонентов дыхательной цепи существуют разные механизмы сопряжения транспорта электронов с перемещением протонов. Аллостерические изменения конформации белковой молекулы, связанные с транспортом электронов, могут в принципе сопровождаться «перекачиванием» протонов, подобно тому как перемещаются протоны при обращении действия АТФ-синтетазы. При переносе каждого электрона хинон захватывает из водной среды протон, который затем отдает при высвобождении электрона. Поскольку убихинон свободно передвигается в липидном бислое, он может принимать электроны вблизи внутренней поверхности мембраны и передавать их на комплекс b-с1 около ее наружной поверхности, перемещая при этом через бислой по одному протону на каждый перенесенный электрон. С помощью более сложных моделей можно объяснить и перемещение комплексом b-c1 двух протонов на каждый электрон, предположив, что убихинон повторно проходит через комплекс b-c1 в определенном направлении.
В отличие от этого молекулы, передающие электроны цитохромоксидазному комплексу, по-видимому, не переносят протонов, и в этом случае транспорт электронов, вероятно, связан с определенным аллостерическим изменением конформации белковых молекул, в результате которого какая-то часть белкового комплекса сама переносит протоны.
Действие разобщителей.
С 40-х годов известен ряд липофильных слабых кислот, способных действовать как разобщающие агенты, т.е. нарушать сопряжение транспорта электронов с синтезом АТФ. При добавлении к клеткам этих низкомолекулярных органических соединений митохондрии прекращают синтез АТФ, продолжая при этом поглощать кислород. В присутствии разобщающего агента, скорость транспорта электронов остается высокой, но протонный градиент не создается. Это простое объяснение этого эффекта: разобщающие агенты (например, динитрофенол, тироксин) действуют как переносчики Н+ (Н+-ионофоры) и открывают дополнительный путь - уже не через АТФ-синтетазу – для потока Н+ через внутреннюю митохондриальную мембрану.[13, 2000]
Дыхательный контроль.
Когда к клеткам добавляют разобщающий агент, например динитрофенол, поглощение кислорода митохондриями значительно возрастает, так как скорость переноса электронов увеличивается. Такое ускорение связано с существованием дыхательного контроля. Полагают, что этот контроль основан на прямом инги6ирующем влиянии электрохимического протонного градиента на транспорт электронов. Когда в присутствии разобщителя электрохимический градиент исчезает, не контролируемый более транспорт электронов достигает максимальной скорости. Возрастание градиента притормаживает дыхательную цепь, и транспорт электронов замедляется. Более того, если в эксперименте искусственно создать на внутренней мембране необычно высокий электрохимический градиент, то нормальный транспорт электронов прекратится совсем, а на некоторых участках дыхательной цепи можно будет обнаружить обратный поток электронов. Это позволяет предполагать, что дыхательный контроль отражает простой баланс между изменением свободной энергии при перемещении протонов, сопряженного с транспортом электронов, и изменением свободной энергии при самом транспорте электронов.Величина электрохимического градиента влияет как на скорость, так и на направление переноса электронов, так же как и на направление действия АТФ-синтетазы.
Дыхательный контроль - это лишь часть сложной системы взаимосвязанных регуляторных механизмов с обратными связями, координирующей скорости гликолиза, расщепления жирных кислот, реакций цикла лимонной кислоты и транспорта электронов. Скорости всех этих процессов зависят от отношения АТФ:AДФ - они возрастают, когда это отношением уменьшается в результате усиленного использования АТФ. Например, АТФ-синтетаза внутренней митохондриальной мембраны работает быстрее, когда концентрации ее субстратов, т. е. .AДФ и Фн, увеличиваются. Чем выше скорость этой реакции, тем больше протонов перетекает в матрикс, быстрее рассеивая тем самым электрохимический градиент; а уменьшение градиента в свою очередь приводит к ускорению транспорта электронов.[1,1994]
Митохондрии бурой жировой ткани – генераторы тепла.
Всем позвоночным в молодом возрасте для образования тепла, в дополнение к механизму мышечного тремора, необходимо термогенное устройство. Такого рода устройство особенно важно для животных, впадающих в зимнюю спячку. Мышцы в состоянии тремора сокращаются и при отсутствии нагрузки, используя сократительные белки для гидролиза АТФ обычным для мышечных клеток образом и освобождая в виде тепла всю энергию, потенциально доступную при гидролизе АТФ. Необходимость особого термогенного устройства определяется прочно сопряженным окислительным фосфорилированием нормальных митохондрий. Если бы этот процесс мог быть разобщен, как это бывает в присутствии динитрофенола, он мог бы служить в качестве адекватного приспособления, производящего тепло; именно так это происходит в митохондриях бурого жира. Хотя эти митохондрий обладают обычной обратимой АТФазой, в них имеется также трансмембранная протонная транслоказа, посредством которой протоны могут возвращаться в матрикс и электрически шунтировать работу АТФазы. Если этот процесс достаточен для того, чтобы поддерживать окислительно-восстановительный потенциал водорода значительно ниже 200 мВ, синтез АТФ становится невозможным и окислительный процесс протекает свободно, в результате чего вся энергия освобождается в виде тепла.[2, 1994]
Цикл лимонной кислоты (цикл трикарбоновых кислот, цикл Кребса).
Цикл лимонной кислоты представляет собой серию реакций, протекающих в митохондриях, в ходе которых осуществляется катаболизм ацетильных групп и высвобождение водородных эквивалентов; при окислении последних поставляется свободная энергия топливных ресурсов тканей. Ацетильные группы находятся в составе ацетил-КоА (активного ацетата), тиоэфира кофермента А.
Главная функция цикла лимонной кислоты состоит в том, что он является общим конечным путем окисления углеводов, белков и жиров, поскольку в ходе метаболизма глюкоза, жирные кислоты и аминокислоты превращаются либо в ацетил-СоА, либо в промежуточные соединения цикла. Цикл лимонной кислоты играет также главную роль в процессах глюконеогенеза, переаминирования, дезаминирования и липогенеза, Хотя ряд этих процессов протекает во многих тканях, печень - единственный орган, в котором идут все перечисленные процессы. Поэтому серьезные последствия вызывает повреждение большого числа клеток печени или замещение их соединительной тканью. О жизненно важной роли цикла лимонной кислоты свидетельствует и тот факт, что у человека почти не известны генетические изменения ферментов, катализирующих реакции цикла, так как наличие таких нарушений несовместимо с нормальным развитием.[10,1993]
Открытие ЦТК.
Впервые предположение о существовании такого цикла для окисления пирувата в животных тканях было высказано в 1937 году Гансом Кребсом. Эта идея родилась у него, когда он исследовал влияние анионов различных органических кислот на скорость поглощения кислорода суспензиями измельченных грудных мышц голубя, в которых происходило окисление пирувата. Грудные мышцы отличаются чрезвычайно высокой интенсивностью дыхания, что делает их особенно удобным объектом для изучения окислительной активности. Кребс также подтвердил, что обнаруженные ранее в животных тканях другие органические кислоты (янтарная, яблочная, фумаровая и щавелевоуксусная) стимулируют окисление пирувата. Кроме того, он нашел, что окисление пирувата мышечной тканью стимулируется шестиуглеродными трикарбоновыми кислотами - лимонной, цис-аконитовой и изолимонной, а также пятиуглеродной a-кетоглутаровой кислотой. Испытаны были и некоторые другие встречающиеся в природе органические кислоты, но ни одна из них не обнаружила подобной активности. Обращал на себя внимание сам характер стимулирующего действия активных кислот: даже малого количества любой из них было достаточно для того, чтобы вызвать окисление во много раз большего количества пирувата.[9, 1991]