Постепенное укорочение ДНК хромосом во время репликации является одной из теорий "старения" клеточных колоний. Еще в 1971 году отечественный ученый А.М. Оловников в своей теории маргинотомии (от лат. marginalis -краевой, tome - сечение) предположил, что это явление лежит в основе ограниченного потенциала удвоения, наблюдаемого у нормальных соматических клеток, растущих в культуре in vitro, так называемого "лимита Хейфлика". Американский ученый Леонард Хейфлик в начале 60-х годов показал, что если для культивирования взять клетки новорожденных детей, то они могут пройти 80-90 делений, в то время как соматические клетки от 70-летних делятся только 20- 30 раз. Ограничение на число клеточных делений и называют лимитом Хейфлика.
Расплетание двойной спирали ДНК
Поскольку синтез ДНК происходит на одноцепочечной матрице, ему должно предшествовать обязательное разделение (хотя бы на время) двух цепей ДНК. Исследования, проведенные в начале 60-х годов на реплицирующихся хромосомах, выявили особую, четко ограниченную область репликации, перемещающуюся вдоль родительской спирали ДНК и характеризующуюся местным расхождением двух ее цепей. Эта активная область из-за своей Y-образной формы была названа репликационной вилкой. Именно в ней ДНК-полимеразы синтезируют дочерние молекулы ДНК. С помощью электронной микроскопии реплицирующейся ДНК удалосьустановить, что область, которая уже реплицирована, имеет вид глазка внутри нереплицировавшейся ДНК. Важно отметить, что репликационный глазок образуется только в тех местах молекулы, где находятся специфические нуклеотидные последовательности. Эти последовательности, получившие название точек начала репликации, состоят приблизительно из 300 нуклеотидов. В зависимости от того, в одном или в двух направлениях происходит репликация (а это зависит от природы организма), глазок содержит одну или две репликационные вилки. Последовательное движение репликационной вилки приводит к расширению глазка.
Двойная спираль ДНК весьма стабильна; для того чтобы она раскрылась, необходимы особые белки. Специальные ферменты ДНК-хеликазы быстро движутся по одиночной цепи ДНК, используя для перемещения энергию гидролиза ATФ. Встречая на пути участок двойной спирали, они разрывают водородные связи между основаниями, разделяют цепи и продвигают репликационную вилку. Вслед за этим с одиночными цепями ДНК связываются специальные дестабилизирующие спираль белки, которые не позволяют одиночным цепям ДНК сомкнуться. При этом они не закрывают оснований ДНК, оставляя их доступными для спаривания.
Не следует забывать, что комплементарные цепи ДНК закручены друг вокруг друга в спираль. Следовательно, для того чтобы репликационная вилка могла продвигаться вперед, вся еще не удвоенная часть ДНК должна была бы очень быстро вращаться. Эта топологическая проблема решается путем образования в спирали своего рода "шарниров", позволяющих цепям ДНК раскрутиться. Принадлежащие к особому классу белки, называемые ДНК-топоизомеразами, вносят в цепь ДНК одноили двухцепочечные разрывы, позволяющие цепям ДНК разделиться, а затем заделывают эти разрывы. Топоизомеразы участвуют также в расцеплении зацепленных двухцепочечных колец, образующихся при репликации кольцевых двунитевых ДНК. С помощью этих важных ферментов двойная спираль ДНК в клетке может принимать "недокрученную" форму с меньшим числом витков; в такой ДНК легче происходит расхождение двух цепей ДНК в репликационной вилке.
Прерывистый синтез ДНК
Легко вообразить, что репликация происходит путем непрерывного роста нуклеотида за нуклеотидом обеих новых цепей по мере перемещения репликационной вилки; при этом, поскольку две цепи в спирали ДНК антипараллельны, одна из дочерних цепей должна была бы расти в направлении 5'-3', а другая в направлении 3'-5'. В действительности, однако, оказалось, что дочерние цепи растут только в направлении 5'-3', то есть всегда удлиняется 3'-конец затравки, а матрица считывается ДНК-полимеразой в направлении 3'-5'. Это утверждение на первый взгляд кажется несовместимым с движением репликационной вилки в одном направлении, сопровождающемся одновременным считыванием двух антипараллельных нитей. Разгадка секрета заключается в том, что синтез ДНК происходит непрерывно только на одной из матричной цепей. На второй матричной цепи ДНК синтезируется сравнительно короткими фрагментами (длиной от 100до 1000 нуклеотидов, в зависимости от вида), названными по имени обнаружившего их ученого фрагментами Оказаки). Вновь образованная цепь, которая синтезируется непрерывно, называется ведущей, а другая, собираемая из фрагментов Оказаки, отстающей. Синтез каждого из этих фрагментов начинается с РНК-затравки. Через некоторое время РНК-затравки удаляются, бреши застраиваются ДНК-полимеразой и фрагменты сшиваются в одну непрерывную цепь ДНК специальным ферментом.
Кооперативное действие белков репликационной вилки.
До сих пор мы говорили об участии отдельных белков в репликации так, как будто бы они работают независимо друг от друга. Между тем в действительности большая часть этих белков объединена в крупный комплекс, который быстро движется вдоль ДНК и согласованно осуществляет процесс репликации с высокой точностью. Этот комплекс сравнивают с крошечной "швейной машиной" : "деталями" его служат отдельные белки, а источником энергии - реакция гидролиза нуклеозидтрифос фатов. Спираль расплетается ДНК-хеликазой; этому процессу помогают ДНК- топоизомераза, раскручивающая цепи ДНК, и множество молекул дестабилизирующего белка, связывающихся с обеими одиночными цепями ДНК. В области вилки действуют две ДНК-полимеразы - на ведущей и отстающей цепи. На ведущей цепи ДНК-полимераза работает непрерывно, а на отстающей фермент время от времени прерывает и вновь возобновляет свою работу, используя короткие РНК-затравки, синтезируемые ДНК-праймазой. Молекула ДНК-праймазы непосредственно связана с ДНК-хеликазой, образуя структуру, называемую праймосомой. Праймосома движется в направлении раскрывания репликационной вилки и по ходу движения синтезирует РНК-затравку для фрагментов Оказаки. В этом же направлении движется ДНК-полимераза ведущей цепи и, хотя на первый взгляд это трудно представить, ДНК-полимераза отстающей цепи. Для этого, как полагают, последня накладывает цепь ДНК, которая служит ей матрицей, саму на себя, что и обеспечивает разворот ДНК-полимеразы отстающей цепи на 180 градусов. Согласованное движение двух ДНК-полимераз обеспечивает координированную репликацию обеих нитей. Таким образом, в репликационной вилке одновременно работают около двадцати разных белков (из которых мы назвали только часть), осуществляя сложный, высокоупорядоченный и энергоемкий процесс.
Согласованность процессов репликации ДНК и клоеточного деления
Эукариотическая клетка перед каждым делением должна синтезировать копии всех своих хромосом. Репликация ДНК эукариотической хромосомы осуществляется посредством разделени хромосомы на множество отдельных репликонов. Такие репликоны активируются не все одновременно, однако клеточному делению должна предшествовать обязательная однократная репликация каждого из них. Из сказанного ясно, что по хромосоме эукариот в каждый момент времени может двигаться независимо друг от друга множество репликационных вилок. Остановка продвижения вилки происходит только при столкновении с другой вилкой, движущейся в противоположном направлении, или по достижении конца хромосомы. В результате вся ДНК хромосо мы в короткий срок оказывается реплицированной. После сборки на молекуле ДНК хромосомных белков каждая пара хромосом в процессе митоза упорядоченно разделяется по дочерним клеткам.
Выводы
Процесс репликации ДНК согласован с клеточным делением и требуетсовместного действия многих белков. В нем участвуют:
1. ДНК-хеликаза и дестабилизирующие белки; они расплетают двойную спираль родительской ДНК и формируют репликационную вилку.
2. ДНК-полимеразы, которые катализируют синтез полинуклеотидной цепи ДНК в направлении 3'-5, копируя в репликационной вилке матрицу с высокой степенью точности. Поскольку две цепи двойной спирали ДНК антипараллельны, в направлении 5'-3' непрерывно синтезируется лишь одна из двух цепей, ведущая; другая цепь, отстающа, синтезируется в виде коротких фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза способна к исправлению собственных ошибок, но не может самостоятельно начать синтез новой цепи.
3. ДНК-праймаза, которая катализирует короткие молекулы РНК-затравки. Впоследствии фрагменты РНК удаляются - их заменяет ДНК.
4.Теломераза, заканчивающая построение недорепликацированых 3'-концов линейных молекул ДНК.
5. ДНК-топоизомеразы, помогающие решить проблемы кручения и спутывания спирали ДНК.
6. Инициаторные белки, связывающиеся в точке начала репликации и способствующие образованию нового репликационного глазка с одной или двумя вилками. В каждой из вилок вслед за инициаторными белками к расплетенной ДНК сначала присоединяется белковый комплекс, состоящий из ДНК-хеликазы и ДНК-праймазы (праймосома).
Затем к праймосоме добавляются другие белки и возникает "репликационная машина", которая и осуществляет синтез ДНК.
Литература
1. О. О. Фаворова. Сохранение ДНК в ряду популяций: репликация ДНК. Соросовский образовательный журнал, 1996 г.
2. Г.М. Дымшиц. Проблема раепликации концов линейных молекул и теломераза. Соросовский образовательный журнал, 2000 г.