По-видимому, самым распространенным в настоящее время является амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глюкозоксидазы для определения сахара в крови. Исторически этот биосенсор является самым "древним". В настоящее время для определения глюкозы создано наибольшее число различных биосенсоров, что связано с необходимостью контроля за содержанием сахара в биологических жидкостях, например в крови, при диагностировании и лечении некоторых заболеваний, прежде всего диабета. Схема функционирования биосенсора на глюкозу в принципе типична и для других амперометрических биосенсоров с аналогичным трансдьюсером. Ток восстановления кислорода на платиновом катоде прямо пропорционален концентрации кислорода. В присутствии субстрата (например, глюкозы в крови, взятой для анализа) ферментативная реакция понижает концентрацию O2.Таким образом, ток восстановления кислорода уменьшается пропорционально концентрации субстрата
Преимущество данного типа биосенсора состоит прежде всего в его высокой селективности. Избирательность подобных биосенсоров определяется высокой специфичностью глюкозоксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуют компоненты ферментативного процесса. В целом класс ферментов - оксидаз является высокоспецифичным по отношению к определяемым субстратам. Системы же на основе небиологического преобразователя, напротив, не столь селективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом причин. Тем не менее имеются ограничения и по применению данной конструкции биосенсора, обусловленные влиянием кислорода и других посторонних веществ, способных проникать через биослой (точнее, через мембрану), а потому задача совершенствования конструкций биосенсоров на глюкозу представляется весьма актуальной.
Один из возможных путей такого усовершенствования заключается в следующем. Если изменить полярность включения электрода-трансдьюсера в глюкозном биосенсоре на противоположную, то есть платиновый катод сделать анодом, то при потенциале +0,6В он становится совершенно нечувствительным к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода, который при данном значении потенциала окисляется до воды. Чувствительность такого электрода к пероксиду водорода оказалась привлекательной, а поскольку вода образуется как продукт ферментативной реакции, по его содержанию можно сделать вывод о концентрации, например глюкозы в различных объектах. Другой способ улучшения селективности биосенсоров и устранения помех от посторонних примесей состоит в использовании различных мембран - пленок, предотвращающих их попадание непосредственно на электрод-преобразователь. При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защиты от примесей, а внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. Однако необходимо отметить, что с помощью специальных приемов, называемых химической модификацией, можно до такой степени изменить свойства поверхности электрода, что он будет "глухим" к большинству примесей и, напротив, чувствительным к компонентам ферментативной реакции.
Биосенсоры, основанные на кислородном электроде как физическом трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: кроме глюкозы - лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты, то есть анионы соответствующих карбоновых кислот. В литературе описаны другие биосенсоры подобного типа, ряд которых применяется на практике.
С помощью биосенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой определенной концентрации субстрата оценивать активность собственно фермента по величине измеряемого сигнала ( потенциала, тока и т. д.). Из описания работы фермента следует, что измеряемый сигнал зависит не только от концентрации субстрата, но и от каталитической активности биологического преобразователя, то есть фермента. Такое использование биосенсоров позволяет измерить активность большого числа ферментов, например в крови. Оценка активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью, таких, как аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа, позволяет в клинических условиях оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы используются в педиатрии.
Биосенсоры на основе других биоматериалов
Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность, использование выполненных на их основе биосенсоров не может быть экономически целесообразным. Поэтому применение бактерий, микроорганизмов и биологических тканей различного происхождения более предпочтительно, поскольку в данном случае отпадает необходимость в предварительном получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких биосенсоров можно отнести низкую селективность определения вследствие того, что клетки живых организмов фактически являются источником самых разнообразных ферментов. Помимо этого время отклика биосенсоров на основе тканей и микроорганизмов может быть достаточно большим, что также уменьшает их практическую ценность. Тем не менее в последнее время наблюдается повышенный интерес к разработке конструкций электродов, содержащих не сами ферменты в очищенном виде, а их первозданные источники - биологические материалы. Так, было установлено, что тканевые срезы в биосенсорах могут выполнять функцию источников каталитической активности. Например, создан биосенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из платинового электрода и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна для проведения 50-80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-ном глицерине.
Аналогичный подход использовали при создании конструкции биосенсора на допамин - важнейший биогенный амин, участвующий в регуляции деятельности мозга. В данном биосенсоре ткань плода банана была иммобилизована на поверхности кислородного электрода. В рассмотренных случаях биоматериалы создают "естественное окружение" для ферментов, способствующее стабилизации их активности. Тканевые материалы достаточно долго сохраняют высокую специфичность, что очень важно для биосенсора, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях быстро разрушаются. Известны биосенсоры, в которых использован цельный фрагмент ткани печени быка, являющийся носителем фермента каталазы и иммобилизованный на кислородном электроде. Ферментативное действие каталазы, проявляющееся в катализе реакции разложения пероксида водорода, используют в этом случае для создания соответствующего электрода. Разработан биосенсор на основе кожуры кабачка или огурца и кислородного электрода для определения L-аскорбиновой кислоты во фруктовых соках, функционирующий подобно аналогичному типу электрода, уже рассмотренного выше. Тем не менее, несмотря на успехи в развитии биосенсоров на основе биологических материалов, надежность их функционирования все еще остается спорной. Еще один пример конструкции биосенсорного устройства относится к ферментному электроду на основе микроорганизмов - дрожжей, помещаемых между двумя пористыми мембранами. Биосенсор на основе иммобилизованных дрожжей и кислородного электрода позволяет определять этанол и метанол, например в промышленных стоках.
Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного сенсора. В качестве примера таких устройств можно упомянуть амперометрический сенсор на аммиак (в сточных водах) на основе иммобилизованных нитрифицирующих бактерий и кислородного электрода. Такой биосенсор полезен при решении вопросов охраны окружающей среды, и в частности при контроле степени очистки промышленных стоков.
Можно отметить также использование биосенсоров на основе гидролаз - ферментов, являющихся катализаторами гидролитического расщепления субстратов. Эти биосенсоры предназначаются, как правило, для эколого-аналитического контроля остаточных количеств пестицидов класса фосфорорганических соединений, а также для определения некоторых ОВ. Если при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образуется электрохимически активное соединение, то, контролируя содержание последнего, можно контролировать ферментативную реакцию так же, как в предыдущих случаях. Однако в присутствии веществ, являющихся ингибиторами, активность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, регистрируемому электродом. Интересно отметить высокую чувствительность такого определения: эффект изменения активности фермента доступен для измерения уже при действии ультраследовых количеств ингибитора - на уровне пико- и фемтограмм
Проблемы и перспективы развития
Концепция распознавания определяемого вещества с помощью иммобилизованного биоматериала оказалась плодотворной. В итоге исследователи приобрели новое средство, позволяющее быстро получить достоверную информацию о состоянии окружающей среды и здоровья человека. Некоторые биосенсоры уже получают распространение для индивидуального использования в домашних аптечках (чаще всего для определения сахара в крови). Интерес к биосенсорам непрерывно растет. В 1996 году состоялись четыре крупные международные конференции по биосенсорам.