3. Материалы и методы
2.1. Материалы
2.1.1. Оборудование
Копалка, термомиксер 5436, центрифуга "Эппиндорф", прибор для горизонтального электрофореза, источник питания 2197, термостат ТС–80 Мг.
| Штамм: | Escherichia coli HB 101 Agrobacterium tumefaciens C58C1 |
| Плазмиды: | рGV3850 |
| тДНК: | рBR322 маркер Ар, Тс |
2.1.3. Растения
В качестве объектов исследования использовали двух–, трехмесячное однодольное растение ряски крошечной (Lemna perpusilla).
Растения выращивали в теплице в вегетационных сосудах при температуре 18–250 С и 12 часовом световом периоде. Относительную влажность воздуха в теплице поддерживали в пределах 65–70%. Для анализа брали стерильные ткани листьев. Стерилизацию проводили гипохлоридом натрия в течение 5–10 минут, а затем материал 3 раза промывали стерильной водой и использовали в экспериментах по индукции vir–генов Ti–плазмид. Для сравнения были взяты двудольные растения табака красного и льна долгунца.
2.1.4. Среды микробиологические для культивирования растений
В работе использовали среды:
1. Для микроорганизмов – LB (Лурия–Бертани)
| NaCl Дрожжевой экстракт Бантотриптон | 10 мг/л 5 г/л 5 г/л |
рН 7,5
Температура 240 С
Длина светового дня 16 часов
На чашку Петри:
| LB штамм | 10 мл 1 мл |
2. Для культивирования растений – среда MS (Мурасиге–Скуча) приведена в таблице.
2.1.5. Другие растворы
Фосфатный буфер
ТЕ буфер (10 мМТрис–HCl (pH 8.0), 1 мМ ЭДТА)
Саркозилат Na
Проназы – 1,5 мг/мл
Фенол
Хлороформ
Агарозные гели
Фитогормоны:
БАП (6–бензиламинопурин) растворяли в растворе 0,1 – NaOH
HУК (2–нафтилуксусная кислота) растворяли в этаноле и разводили водой до 10 мг/мл. Стерилизовали фильтрованием через фильтры В 485.
Ацетосирингон растворяли в 70% спирте (этаноле) в концентрации 10 мг/мл. Добавляли в среду MS до конечной концентрации 100 мМ.
2.1.6. Ферменты, используемые в генной инженерии
Гидролиз ДНК проводили рестрикционными эндонуклеазами:
Hind III, Bam Hi, Sal I, Eco RI.
2.1.7. Антибиотики
Ампицилин 50, Н2О 50. Для селекции бактерий с определенными плазмидами.
2.2. Методы
2.2.1. Инкубация Agrobacterium tumefaciens с экссудатами тканей растений
Ночную культуру A. tumefaciens С58С1 (pGV3850), выращенную на ротационном шейкере (20 циклов/мин) при 290 С в жидкой среде LB, собирали центрифугированием и суспензировали в среде МС – 0,1 М фосфатном буфере (рН 5,5) до кислотности А600 – 0,05.
После 5 часов роста в бактериальную культуру добавляли мелконарезанные стерильные ткани растений (листья, стебли) в количестве 2 г на 10 мл среды и продолжали инкубацию в течение 48 часов.
В качетве положительного контроля использовали агробактериальную культуру с добавлением в качестве индуктора 100 мкМ ацетосирингона. В качестве отрицательного контроля использовали агробактериальные клетки, выращенные на среде без ацетосирингона и эксцудатов растений.
Эффективность индукции процессинга тДНК церез 48 часов инкубации агробактерий с тканями растений. Титр жизнеспособных бактерий после инкубации с эксцудатами растений проверяли путем их высева в различных разведениях на чашки Петри с агаризованной средой LB. Каждый вариант опытов проводили в трех повторностях.
2.2.2. Выделение тотальной ДНК Agrobacterium tumefaciens
ДНК выделяли по модифицированному методу Draper с соавт.Через 48 часов совместного культивирования агробактерий с тканями растений из пробирок удаляли растительную ткань, бактерии собирали, центруфугировали при 9000 g. Осадок, полученый из 10 мл инкубационной среды лизировали в течение 45 мин при 370 С в 500 мкл ТЕ буфера (10 мМ трисHCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА), содержащего 1% сарколизата Na и 1,5 мг/мл проназы. Лизат дважды экстрагировали фенолом и дважды хлороформом. ДНК осаждали спиртом и растворяли в ТЕ–буфере.
2.2.3. Блод-гибридизация тДНК по Саузерну
В целях дополнительной проверки наличия индукции процессинга и присутствия в пробах pBR322 татальную ДНК агробактерий в количестве 5 мкг наносили в лунки 0,8% агарозного геля и проводили электрофорез при 25–100 В в течение 2 часов в буфере, содержащем: 40 мМ трис–ацетат (рН 8,0), 1 мМ ЭДТА и 5 мкг/мл бромистого этидия. В качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага l, гидролизованную рестриктазной эндонуклеазой Hind III. Блод–гибридизацию проводили на ––––– фильтрах. В качестве зонда использвали ДНК плазмиды pBR322, меченную 32 –– с помощью ДНК–полимеразной системы.
2.2.4. Трансформация клеток Esherichia coli
Штаммы E. сoli HB101 выращивали в жидкой среде LB при 370 С до концентрации 5*107 клеток/мл (А600 = 0,45). Для количественного изучения процессинга тДНК использовали комплементарные клетки бесплазмидного штамма E. сoli HB101, которые трансформировали тотальной ДНК агробактерий, которая была выделена (М-2), претерпевших различную переработку. Трансформанты каждого варианта высевали на три чашки Петри с агаризированной средой LB, содержащей ампицилин (50 мкг/мл). Количество колоний подсчитывали. В контрольных экспериментах клетки трансформировали плазмидой pBR322, и другой контроль не был подвергнут трансформации и колоний обнаружено не было.
3. результаты
Для обнаружения процессинга агробактериальной тДНК, индуцированного экссудатами анализированных растений, в работе применяли метод "спасения плазмиды", предложенный Koukolikova-Nikola с соавт. Этот метод основан на использовании модифицированной Ti-плазмиды pGV385 [11], содержащей между правой и левой границами значительно делетированной исходной тДНК бактериальной плазмиды вектор pBR322. Таким образом, индуцирование процессинга тДНК в модифицированной Ti-плазмиде pGV3850 можно прослеживать по вырезанию из нее низкомолекулярного фрагмента ДНК, в состав которого входит плазмида pBR322. Этот процесс можно тестировать различными методами. Один из них – это трансформация клеток E. сoli тотальной агробактериальной ДНК и отбор трансформантов по селективным маркерным признакам плазмиды pBR322 – устойчивой к антибиотикам. Другим методом может быть блод-гибридизация – анализ тДНК с помощью плазмиды pBR322 в качестве гибридизационного зонда. Оба этих метода были использованы в настоящей работе. Сравнили эффективность индукции процессинга экссудатами различных растений проведено по отношению к активности 100 мкМ ацетосирингона. Известно, что это токсифенольное соединение, выделяемое некоторыми двудольными растениями, принадлежит к сигнальным молекулам, индуцирующим вырезание и перенос агробактериальной тДНК.
Результаты трансформации клеток E. сoli НВ101 тДНК подвергнутых воздействию экссудатов листьев различных растений представлены в таблице.
Таблица 3.1.
| Факторы индукции | Количество трансформированных E. Coli |
| L. perpusilla (ряска) L. perpusilla (ряска) Ацетосирингон (контроль) Лен долгунец Nicotiana tabacum (табак) Без ацетосирингона и трансформации | 25 колоний 30 колоний 35 колоний 40 колоний 30 колоний – |
Экссудаты листьев ряски индуцировали вырезание тДНК, что является доказательством присутствия в их составе сигнальных соединений, специфических для индукции транскрипции генов vir агробактериальной Ti-плазмиды.
Прямой блод-гибридизационный анализ тДНК агробактерий свидетельствует о присутствии у ряски сигнальных молекул, индуцирующих образование тДНК [12].
4. обсуждение
Использованный подход позволяет регистрировать присутствие сигнальных молекул в экссудатах различных тканей растений по одному из важнейших результатов индукции генов области vir, а именно по вырезанию тДНК из агробактериальной Ti-плазмиды. В настоящей работе мы применили два метода детекции процессинга тДНК модифицированной агробактериальной Ti-плазмиды. PGV3850 [11].
Полученные результаты позволяют расширить список однодольных растений (на одно растение), синтезирующих сигнальные молекулы, индуцирующие процессинг агробактериальной тДНК. Примененный метод "спасения плазмиды" позволяет выявлять появление циклических форм модифицированной тДНК pBR322 и ее линейных форм [20].
Рассмотренный в работе метод позволяет учитывать присутствие в экссудатах растений веществ с бактериостатической активностью. Вещества такой природы могут существенно влиять на эффективность трансформации растений агробактериями.
Мы не анализировали химическую природу сигнальных молекул ряски. Не исключено, что сигнальные молекулы могут отличаться от сигнальных фенольных соединений двудольных растений. Специфический процесс взаимодействия между агробактериями и покрытосеменными растениями существовал, по-видимому, еще до их дивергенции на двудольные и однодольные [15].
Штаммы агробактерий обладают многими особенностями и именно рецепторы (продукты гена vir A), различающиеся по способности узнавать сигнальные молекулы различной природы.