Мембранная энзимология (стр. 8 из 10)
В отличие от дыхательной цепи основные мембранные комплексы представлены в фотосинтетической системе примерно в эквимо-лярном соотношении. Однако какие-либо серьезные указания в литературе на формирование суперкомплексов отсутствуют. Напротив, для данной системы характерна поразительная латеральная гетерогенность, в результате которой фотосистема II оказывается локализованной в гранальных, плотно упакованных участках, а фотосистема I и сопрягающий фактор - в стромальных участках тилакоида. Пластохинон и комплекс, по-видимому, распределены между этими участками равномерно. Вследствие такого латерального разделения для сопряжения двух фотосистем необходима диффузия на расстояние по крайней мере 1000 А. Скорее всего основным переносчиком восстановительных эквивалентов на такие расстояния является пластохинон, хотя скорость его латериальной диффузии точно не известна. В оптимальных условиях лимитирующей стадией, вероятно, является окисление пластохинона £б/-комплексом, однако связано ли это со скоростью его латеральной диффузии или с работой самого фермента - неясно.
Латеральное разделение компонентов цепи в тилакоидах явно не способствует ускорению переноса электронов между ферментами. Возможно, оно необходимо для эффективного перераспределения световой энергии между двумя фотосистемами. Фосфорилирование белка светособирающего комплекса II приводит к его перераспределению между гранальными и стромальными участками мембраны, облегчая его взаимодействие с фотосистемой I в стромальных участках, что в свою очередь увеличивает долю энергии возбуждения, поступающей на реакционные центры фотосистемы I.
5.5 Взаимодействия между мембранными и растворимыми ферментами
Биомембраны играют важную роль в функционировании целого ряда растворимых ферментов. После разрушения клетки многие ферменты можно обнаружить и в растворимой, и в мембранной фракциях. Отнесение некоего фермента к классу периферических мембранных белков зависит от силы его взаимодействия с мембраной и способа выделения. Кроме того, некоторые растворимые ферменты в специфических условиях связываются с мембраной, и, следовательно, в зависимости от физиологического состояния клетки локализуются либо на мембране, либо в цитозоле. Кроме того, существует группа растворимых ферментов, катализирующих реакции с участием мембраносвязанных субстратов. Для функционирования такие белки должны быть способны хотя бы временно связываться с мембраной.
Во всех этих случаях мембрана выполняет следующие функции:
1) определяет локализацию или компартментацию фермента или группы ферментов;
2) осуществляет аллостерическую активацию или инактивацию ферментов в определенных условиях или в определенной области в клетке;
3) создает среду, в которой липофильные субстраты могут быть превращены в соответствующие продукты.
6. Растворимые ферменты, которые при необходимости могут связываться с мембраной
Пока эта важная группа насчитывает небольшое число ферментов, но, по-видимому, в недалеком будущем их список увеличится. Наиболее характерный пример - протеинкиназа С, хотя и другие представители этой группы неплохо охарактеризованы.
6.1 Протеинкиназа С
Это ключевой фермент системы передачи сигнала, запускаемого быстрым расщеплением фосфатидилинозитолов в плазматической мембране. Такие внеклеточные вещества, как нейромедиаторы, гормоны или факторы роста, связываются со специфическими рецепторами на поверхности клетки. Это приводит к активации фосфолипазы С, которая начинает гидролизовать фосфатидилинозитолы с образованием вторых посредников. Один из продуктов гидролиза, инозитол-1,4,5-трифосфат, вызывает увеличение концентрации свободного кальция внутри клетки. Второй продукт, 5я-1,2-диацилглицерол, активирует протеинкиназу С, что в свою очередь приводит к фосфорилированию целого ряда белков-мишеней, многие из которых, например рецептор фактора роста эпидермиса, являются мембраносвязанными. Согласно современным представлениям, данная система участвует в осуществлении целого ряда клеточных функций, в частности в делении, дифференцировке и экзоцитозе.
До активации клетки какими-либо экзогенными агентами протеинкиназа С остается неактивной и обнаруживается только в цитозоле. Однако после стимуляции клетки фермент быстро активируется и оказывается в мембранных фракциях. Исследования invitro показали, что для связывания с мембраной и активации необходимы кислые фосфолипиды, а также Са2+ и диацилглицерол. Специфичность к фосфолипиду, необходимому для активации, до некоторой степени зависит от природы субстрата. Для активации фосфотрансферазной активности фермента можно добавить прямо к клеткам проникающие через мембрану коротко цепочечные диацилглицеролы, например диоктаноилглицерол. Природные вторые посредники, длинноцепочечные диацилглицеролы, нерастворимы в воде и остаются в мембране. Аналогичное действие оказывают, по-видимому, промоторы опухолевого роста форболовые эфиры: как показано, они способны связываться с ферментом и вызывать те же изменения, что и эндогенный сигнал. После связывания форболовых эфиров или диацилглицеролов возрастает сродство фермента к Са2+ и фосфатидилсерину. Показано, что эффективным конкурентным ингибитором фермента является сфингозин.
На самом деле протеинкиназа С представлена несколькими разными, но близкими по структуре полипептидами с мол. массой - 80000. Например, из мозга кролика выделено три формы. Протеинкиназа С имеет двухдоменную структуру. Один домен содержит каталитические центры, связывающие АТР и белок-субстрат, и функционирует как сериновая и треониновая фосфотрансфераза. Второй домен, по-видимому, участвует в связывании фосфатидилсерина, диацилглицерола и Са2+. С помощью мягкого протеолиза можно разделить два этих домена, получив полностью активный каталитический фрагмент с мол. массой - 50000. Таким образом, активировать фермент можно двумя взаимоисключающими способами: протеолизом и связыванием с мембраной. Таким же образом ведут себя и некоторые другие липидзависимые ферменты, например пируватоксидаза. Физиологическое значение протеолитической активации неясно.
Очищенный фермент был встроен в фосфолипидные везикулы и в смешанные везикулы, содержащие тритон Х-100 и фосфолипиды. В обоих случаях было показано, что само по себе связывание липида ферментом необходимо, но не достаточно для проявления ферментативной активности. Например, для связывания фермента с фосфолипидными везикулами достаточно 2 "Уо фосфатидилсерина, в то время как для оптимального фосфорилирования его необходимо уже 50. В норме содержание фосфати-дилсерина в плазматической мембране составляет 8-10%. Поскольку фермент активируется в смешанных мицеллах, содержащих примерно 20 мол. % фосфатидилсерина в тритоне Х-100, наличие бислойной структуры не является необходимым, что, вообще говоря, весьма типично для липидзависимых ферментов. Зависимость наблюдаемой активации от концентрации фосфатидилсерина свидетельствует о кооперативном характере взаимодействий фермента и липида, что также довольно обычно. По оценкам функционально активный фермент представляет собой комплекс, содержащий мономер фермента, одну молекулу диацилглицерола, один или более ионов Са2+ и по крайней мере четыре молекулы фосфатидилсерина. Связывание всегда происходит с поверхностью мембраны, но роль Са2+ неизвестна. Он может, например, хелатировать карбоксильные группы фосфатидилсерина и какие-то группы в белке и/или играть роль аллостерического регулятора при связывании белка. Тот факт, что фермент может быть помечен иодонафталин-1-азидом, служит указанием на некоторое проникновение белка в гидрофобную зону бислоя, но не более того.
6.2 Эффект поверхностного разведения в смешанных мицеллах
Рис. иллюстрирует интересную особенность протеинкиназы С и других мембранных ферментов, выявляемую при измерении их активности в системах со смешанными мицеллами. В этом эксперименте измеряли зависимость способности фермента связывать форболовый эфир от концентрации тритона Х-100. Если поддерживать постоянным содержание фосфатидилсерина в мольных процентах, а концентрацию тритона Х-100 увеличивать, то фермент будет связывать форболовый эфир даже при высокой концентрации детергента. Однако если поддерживать постоянной объемную концентрацию фосфолипида и увеличивать количество детергента, то фермент перестанет связывать форболовый эфир при высоких концентрациях тритона Х-100. Для активации фермента важна не объемная, а поверхностная концентрация липида, иными словами, число молекул липида на мицеллу. Если эта величина падает, то уменьшаются также способность фермента связываться с такими смешанными мицеллами и способность активироваться. Это явление называется явлением поверхностного разведения.
