Степень метилирования этих тетрануклеотидов определяли с помощью метилчувствительной рестриктазы AciI, которая способна расщеплять узнаваемый сайт только в том случае, если он не содержит метилированный цитозин. Обработанные AciI препараты ДНК, выделенные из разных органов/линий картофеля, использовали в качестве матриц для ПЦР с праймерами на исследуемый участок В33-промотора или на участок промотора и начало гена GUS. ПЦР на матрицах необработанных рестриктазой препаратов ДНК из разных органов приводила к наработке примерно равных количеств амплифицируемой ДНК В33-промотора. Это указывало на сходство набора матриц и их доступности в препаратах ДНК, выделенных из разных органов растения. Однако после рестрикции AciI количества получаемых ампликонов сильно различались в зависимости от источника ДНК. Наиболее бледными были полосы ампликонов, полученные с использованием рестрицированных ДНК из клубней и листьев анализируемых растений. Это свидетельствует о значительной степени расщепления пататинового промотора рестриктазой AciI, т.е. о низком уровне его метилирования в данных органах. Максимальный уровень метилирования промотора был выявлен в корнях и стеблях растений картофеля.
Существенных различий между трансгенными и нетрансгенными растениями картофеля по уровню метилирования GCGG-сайтов промотора не обнаружено. Органная специфичность метилирования встроенного В33-промотора в B33::GUS-трансформантах была сходной со специфичностью метилирования эндогенного пататинового промотора. Обнаружена существенная обратная корреляция между уровнем метилирования GCGG-сайтов В33-промотора и уровнем его активности в органах растений. Вместе с тем, неполная обратная корреляция метилирования и экспрессии В33-промотора в разных органах предполагает участие, помимо метилирования, и других регуляторных факторов, определяющих органную специфику промоторной активности.
Изменение расположения хромосомных генов
Согласно современным представлениям, как интерфазные хромосомы, так и гены занимают в ядре достаточно жестко определенные радиальные положения. Считается общепринятым тот факт, что близкое расстояние между локусами может являться причиной незаконной рекомбинации между ними, часто приводящей к развитию лейкозов. Возникающие в результате транслокаций лейкозы, могут носить как первичный, так и вторичный характер. Возникновение вторичных лейкозов связывают с терапией рака ингибиторами ДНК топоизомеразы II. ДНК топоизомераза II является жизненно необходимым ферментом, так как катализирует топологические изменения в ДНК в ходе сегрегации дочерних хромосом после завершения процесса репликации ДНК, транскрипции, рекомбинации и реорганизации хроматина. Именно поэтому при терапии раковых заболеваний применяются препараты, ингибирующие активность топоизомеразы II и вызывающие гибель активно делящихся клеток.
В настоящей работе исследовалось взаимное пространственное расположение генов, являющихся частыми партнерами при транслокациях, ведущих к возникновению первичных и вторичных лейкозов (AML/ETO, MLL/AF4, AF6, AF9, BCR/ABL).
Методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) было показано, что радиальное распределение флуоресцентных сигналов, соответствующих гену ETO и хромосомной территории 8-ой хромосомы во внутриядерном пространстве делящихся клеток является случайным. Также было показано, что при обработке клеток этопозидом (VP16) - ингибитором ДНК топоизомеразы II - характер распределения сигналов резко меняется и сигналы, в значительной степени, группируются на внутриядерной орбите, соответствующей 45% радиуса ядра.
Для частого партнера гена ETO по транслокациям, гена AML, было показано, что основная масса сигналов, соответствующих гену AML и хромосомной территории 21-ой хромосомы в интактных клетках, сосредоточена на той же орбите (45% радиуса ядра), и что такое распределение сигналов не изменяется после обработки клеток этопозидом. Анализ размера геномной ДНК с применением метода электрофоретического разделения ДНК в пульсирующем поле показал возникновение большого числа разрывов в ДНК вследствие обработки клеток этопозидом.
Таким образом, продемонстрировано, что в условиях, имитирующих противораковую терапию, происходит сближение генов ETO и AML. Это сближение, сопровождающееся расщеплением ДНК ингибитором топоизомеразы II, может вести к хромосомным транслокациям и развитию вторичных лейкозов.
Предполагается, что анализ изменений радиального распределения возможных генов-партнеров по транслокациям во внутриядерном пространстве делящихся клеток при терапии онкологических заболеваний с применением различных типов химиотерапевтических агентов, может лечь в основу тест-системы, направленной на прогнозирование и предотвращение случаев возникновения вторичных лейкозов.
Модифицированные гены
Интеграция ДНК вируса иммунодефицита человека в геном клетки является ключевой стадией жизненного цикла вируса, поэтому представляет интерес разработка препаратов, подавляющих активность вирусного фермента интегразы. К настоящему моменту найден ряд эффективных ингибиторов интегразы, действующих на активный центр фермента, однако быстро развивающаяся устойчивость вируса к этим препаратам делает актуальной разработку новых ингибиторов интегразы.
Ранее нами было показано, что конъюгаты 11-звенных одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными молекулами, такими как эозин, флуоресцеин и олеиновая кислота, эффективно подавляют активность интегразы in vitro, связываясь с комплексом интеграза-вирусная ДНК и разрушая его. Для определения участка связывания конъюгата было проведено ковалентное присоединение конъюгата олигонуклеотида с флуоресцином к ферменту и протеолитическое расщепление продукта присоединения. Масс-спектрометрический анализ образовавшихся нуклеотидопептидов позволил установить, что ингибитор взаимодействует с интегразой вблизи Lys236 в C-концевом домене фермента. Для подтверждения сайта связывания конъюгата мы провели замену Lys236 в составе интегразы на Ala. Такая аминокислотная замена резко снижала как способность фермента связывать вирусную ДНК, так и его каталитическую активность.
Основываясь на полученных данных, мы высказали предположение о механизме действия конъюгатов. Согласно нашим представлениям, отрицательно заряженная олигонуклеотидная часть конъюгата связывается с С-концевым доменом интегразы, содержащим большое количество положительно заряженных аминокислот, за счет электростатических взаимодействий, в то время как гидрофобная часть проникает в гидрофобный кор домена.
Заключение
Таким образом для нескольких оперонов обнаружен эффект значительного различия интенсивности транскрипции индивидуальных генов. Такие взаимодействия между олигонуклеотидным конъюгатом и комплексом интегразы с вирусной ДНК вызывают конформационные изменения в ферменте, приводящие к диссоциации комплекса. Мы полагаем, что при замене Lys236 на гидрофобный остаток Ala структура С-концевого домена аналогичным образом меняется, что приводит к снижению каталитической активности фермента и его способности связывать вирусную ДНК. Таким образом, мы показали, что олигонуклеотидные конъюгаты являются высокоэффективными ингибиторами интегразы ВИЧ-1, которые, в отличие от большинства существующих ингибиторов, связываются вне активного центра фермента и подавляют активность интегразы по новому механизму.
Список литературы
1. Концепция перехода Российской Федерации к устойчивому развитию. М., 2006.
2. Lande R. Statistic and partitioning of species diversity and similarity among multiple communities // Oikos. 2006. V. 76.
3. Summerville K. S., Boulware M. J., Veech J. A., Crist T. O. Spatial variation in species diversity and composition of forest lepidoptera in eastern deciduous forests of North America // Cons. Biol. 2008. V. 17.
4. Wagner H. H., Wlidi O., Ewald C. W. Additive partitioning of plant species diversity in an agricultural mosaic landscape // Landscape Ecology. 2009.
5. Гиляров М.С., Стриганова Б.Р. Количественные методы в почвенной зоологии. М. Наука. 2007.
6. Flegg J.J.M. Extraction of Xiphinema and Longidorus species from soil by a modification of Cobb's decanting sieving technique // Ann. Biol. 2007.
7. Seinchorst J.W. A rapid method for the transfer of nematodes from fixative to anhydrous glycerin // Nematologica. 2007. Vol. 4.
8. Шестаков Л.С., 2008. «К изучению вибрационных сигналов клопов-щитников (Heteroptera, Asopinae) европейской части России.//Зоол. Журнал Т. 87. №1. с.36-41.
9. Gogala M., 2007. Vibration producing structures and songs of terrestrial Heteroptera as systematic character. / Biol. Vestn. 32. T. 1. P. 19-36.
10. Ванюшин Б. Ф. (2007) Энзиматическое метилирование ДНК – эпигенетический контроль за генетическими функциями клетки // Биохимия, №70, 598-611.
11. Rocha-Sosa M., et al. (2009) Both developmental and metabolic signals activate the promoter of a class I patatin gene // The EMBO Journal, № 8, р. 23-29.
12. ЮнусоваА.К., РогулинЕ.А., АртюхР.И., ЖелезнаяЛ.А., МатвиенкоИ.Н. (2007) Никаза N.Вsp6I – большаясубъединицагетеродимернойэндонуклеазырестрикции R.BspD6I // Биохимия, т. 71, № 7.
13. ЖелезнаяЛ.А., ПеревязоваТ.А., АльжановаД.В., МатвиенкоН.И. (2008) Сайт-специфическаяниказаизштамма Bacillus species D6 // Биохимия, т. 66, №9.
14. Kachalova G.S., Rogulin E.A., Artyukh R.I., Perevyazova T.A., Zheleznaya L.A., Matvienko N.I. and Bartunik H.D. (2008) Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the site-specific DNA nickase Nb.BspD6I. Acta Crystallographica F61.
15. Kim SH, Ryabov EV, Kalinina NO, Rakitina DV, Gillespie T, MacFarlane S, Haupt S, Brown JW, Taliansky M. Cajal bodies and the nucleolus are required for a plant virus systemic infection.EMBO J. 2008 Apr 18;26(8):2169-79. Epub 2007 Apr5.
16. Kim SH, Macfarlane S, Kalinina NO, Rakitina DV, Ryabov EV, Gillespie T, Haupt S, Brown JW, Taliansky M. Interaction of a plant virus-encoded protein with the major nucleolar protein fibrillarin is required for systemic virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jun 26;104(26):11115-20. Epub 2008.
17. Чертопруд М.В., 2008. Родниковые сообщества макробентоса Московской области // Журнал Общей Биологии. 67. 5.