И кальпаин I, и кальпаин II в нервной ткани обнаруживаются как в растворимой, так и в связанной с мембранами и цитоскелетом формах, причём если на долю мембраносвязанной mCANP приходится -% от общего количества mCANP в клетке, то на долю мембраносвязанной mCANP приходится около % от общего количесва mCANP . Мембраносвязанная форма CANP ассоциирована преимущественно с миелином, но обнаруживается и в синаптических мембранах .
CANP обнаружена практически во всех тканях млекопитающих. Её содержания в ЦНС достаточно высокое . Наибольшая активность кальпаина обнаруживается в спинном мозге, несколько меньше – в амигдале, среднем мозге и белом веществе мозжечка. Активность фермента в коре больших полушарий и сером веществе мозжечка достаточно низкая . То есть, наиболее высокое содержание кальпаина наблюдается в богатых миелином областях. Фермент обнаружен как в нейронах, так и в глии . Он локализован преимущественно в нейронах неокортекса и пирамидных нейронах гиппокампа, идентифицирован в перикарионе и проксимальных дендритах этих нейронов .
CANP расщепляет большинство белков цитоскелета и нейрофиламентов, белки микротрубочек, основной белок миелина, глиальный фибриллярный кислый белок, тубулин, спектрин, миофибриллярные белки и окисленную B цепь инсулина, виментин, рецептор фактора роста эпидермиса, быстро транспортируемые белки, cdk активатор белка p, эукариотический фактор инициации G . Кальпаин также активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, осуществляет ограниченный протеолиз фодрина . Имеются сведения о том, что CANP расщепляет предшественник киоторфина, динорфин -, BAM-P, a- и b-неоэндорфины, ангиотензин I и нейротензин, а также синтетические субстраты Suc-Leu-Met-NHMec, Suc-Leu-Tyr-NHMec, Boc-Val-Leu-Lys-NHMec, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-NHMec, Boc-Leu-Thr-Arg-NHMec .
Активность фермента подавляется эндогенными ингибиторами тиоловых протеиназ цистатинами, кининогенами, ингибиторами тиоловых протеиназ из плазмы крови . Кроме этих неспецифичных ингибиторов, в различных тканях животных, в том числе и мозге, обнаружены специфичные ингибиторы CANP – кальпстатины, не влияющие на активность других протеиназ. Ингибиторы из разных тканей имеют несколько отличающиеся свойства, их молекулярная масса колеблется от кДа до кДа. Однако высокомолекулярные кальпстатины, имеющие несколько ингибиторных центров, могут подвергаться протеолизу, при этом образуются фрагменты, сохраняющие ингибиторную активность, но обладающие меньшим числом связывания с ферментом. Молекулярная масса самого короткого фрагмента, сохраняющего ингибиторную активность, составляет кДа . То есть, все многообразные формы кальпстатинов, обнаруженные в различных тканях, могут, вероятно, образовываться из одного предшественника в результате его протеолитического расщепления различной глубины. При взаимодействии кальпстатина с CANP происходит протеолиз кальпстатина, при этом образуются связанные с ферментом фрагменты, подавляющие его активность. Распределение ингибитора CANP в ЦНС соответствует таковому CANP, в особенности mCANP .
В различных тканях обнаружен эндогенный активатор CANP. Активатор CANP из мозга представляет собой термостабильный гомодимер с молекулярной массой кДа, он повышает активность только микро-кальпаина примерно, но при этом не изменяет сродства фермента ни к субстрату, ни к ионам Ca+ . Активатор кальпаина связывается с каталитической кДа субъединицей фермента, вызывая диссоциацию гетеродимера фермента, а затем усиливает автолиз каталитической субъединицы, что и приводит к активации кальпаина . В мозге обнаружены растворимая и связанная с мембранами (цитоскелетом) формы активатора .
Исходя из способности CANP с высоким сродством гидролизовать многие белки микротрубочек и белки цитоскелета, представляется, что основные функции кальпаина нервной системы состоят в ограниченном протеолизе этих белков, что может приводить к изменению физико-химических и функциональных свойств данных белков в зависимости от потребности клетки . Фермент, вероятно, может участвовать в регуляции концентрации различных рецепторов на поверхности клеточных мембран как путём их прямого протеолиза, так путём протеолиза фодрина . Кроме того, CANP активирует кальций-активируемую фосфолипид-зависимую протеинкиназу, вовлекающуюся во внутриклеточный ответ на воздействие некоторых гормонов, и гидролизует эукариотический фактор инициации G . Таким образом, ограниченный протеолиз кальпаином специфичных белков может быть частью внутриклеточного механизма действия некоторых гормонов. CANP также вовлекается в процессы димиелинизации и клеточного апоптоза .
Синаптическая локализация CANP, его участие в гидролизе некоторых нейропептидов, вызывает соблазн предположить возможность её участия в обмене биологически активных пептидов, однако кальпаин локализован на внутренней, а не на внешней поверхности синаптической мембраны и поэтому вряд ли может вовлекаться в деградацию нейропептидов in vivo.
Эндопептидаза . (NEP, нейтральная эндопептидаза, энкефалиназа, энкефалиназа A, неприлизин, CALLA) – интегральный трансмемранный белок плазматических мембран, катализирующий расщепление пептидных связей внутри низкомолекулярных пептидов с N-конца остатков гидрофобных аминокислот. Она выделена и очищена из почек, семенников, гипофиза, мозга, стриатума различных видов животных. Фермент из различных источников имеет очень близкие иммунологические и физико-химические свойства, но отличается степенью гликозилирования . Поэтому молекулярная масса фермента из различных органов и тканей варьирует в пределах от кДа до кДа. Имеется единичное сообщение об обнаружении формы NEP с Mr около кДа, однако наличие этой формы может быть обусловлено агрегацией молекул фермента посредством дисульфидных мостиков . Различия в степени гликозилирования могут обуславливать и колебания pI от, до, .
NEP проявляет максимальную активность при pH около, и является Zn+-зависимой металлоэндопептидазой. Она сильно ингибируется о-фенантролином, ЭДТА, дитиотреитолом, химостатином, фосфатом и NaCl, специфичными ингибиторами тиорфаном и фосфорамидоном и другими синтетическими ингибиторами . N-этилмалеимид, ПХМБ, ФМСФ, апротинин, пуромицин, бацитрацин, ингибиторы АПФ каптоприл, SQ, SQ не влияют на её активность . Активность фермента подавляется некоторыми биологически активными пептидами и их фрагментами: Leu-энкефалином (IC мкМ), Met-энкефалином (IC мкМ), ангиотензинами I и II (IC мкМ), брадикинином (IC мкМ), Tyr-Gly-Gly-Phe (IC мкМ) . Не исключено, что in vivo вышеперечисленные пептиды могут участвовать в регуляции активности фермента.
Нейтральная эндопептидаза расщепляет низкомолекулярные пептиды (с молекулярной массой, как правило, не более Да, единственное исключение интерлейкин b), состоящие не менее чем из аминокислотных остатков с N-конца гидрофобных аминокислот. Наиболее специфичным субстратом для фермента следует считать дансил-Gly-pNOPhe-bAla (Km мкМ), однако не исключено, что и он может расщепляться отличными от NEP эндопептидазами. Эндопептидаза . in vitro расщепляет различные биологически активные пептиды и их фрагменты с Km порядка - мкМ .
NEP широко распространена в тканях млекопитающих. Максимальное количество фермента содержиться в почках, примерно в раза меньшее – в семенниках, ещё в раза меньшее – в лимфатических узлах. Содержание фермента в различных отделах кишечника составляет -%, в поджелудочной железе, надпочечниках, аденогипофизе и спинном мозге – около % от такового в почках. В отделах головного мозга содержание фермента в - раз меньше, чем в спинном мозге. Максимальная активность NEP обнаружена в стриатонигральном пути, в - раз ниже (в порядке убывания) – в мозжечке, коре больших полушарий и таламусе .
В нервной системе NEP обнаружена в нейронах, Шванновских клетках периферических нервов, формирующих миелин, гонадотропных клетках гипофиза . Фермент локализован на пресинаптической и постсинаптической мембранах и мембранах терминалей аксонов . На мембранах дендритов и клеток глии он не обнаруживается . В стриатонигральном пути фермент связан с афферентными волокнами . Показана локализация молекул NEP вблизи m- и/или d-опиоидных рецепторов и рецепторов вещества P .
Полагают, что биологическая роль NEP в ЦНС заключается в генерализованной деградации нейропептидов после связывания последних с рецепторами и модуляции нейропептидов после их секреции из пресинаптической мембраны . Однако NEP не является ферментом, отвечающим за деградацию одного какого-то определённого нейропептида или группы нейропептидов, а вовлекается в деградацию большого числа нейропептидов .
Эндопептидаза . (КФ ...) – цинк-зависимый металлофермент, состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой от кДа до кДа, проявляет максимальную активность при pH около,, активируется дитиотреитолом. Он ингибируется ЭДТА, ЭГТА,-фенантролином, N-этилмалеимидом, гидроксимеркурийбензоатом и специфическим ингибитором N-[-(R,S)-карбокси--фенилпролил]-Ala-Ala-Phe-п-аминобензоатом . ФМСФ не влияет на его активность .
Наиболее высокое содержание фермента обнаружено в мозге, семенниках и гипофизе, в остальных тканях содержание фермента очень низкое . В мозге наиболее высокая активность фермента найдена в клетках Пуркинье мозжечка, клетках зубчатой извилины гиппокампа и отдельных ядрах гипоталамуса . Эндопептидаза . обнаружена как в нейронах, так и в клетках глии . Около % фермента находится в растворимой форме и % связано с мембранами .