Для окраски клеток крови, костного мозга или культур клеток из лимфоидных органов обычно применяют окраску по методу Романовского—Гимзы.
Обнаружение вирусов в реакции иммунофлуоресценции.
В том случае, если размножение вируса в культуре клеток не сопровождается цитопатическим эффектом, гемадсорбцией, его присутствие можно обнаружить с помощью флуоресцирующих антител. Этот метод широко используют при диагностике классической чумы свиней, парвовирусной инфекции свиней и других болезней.
Метод, основанный на интерференции вирусов.
Построен на том, что некоторые вирусы в культуре клеток снижают способность размножаться в ней других вирусов. Например, вирус чумы свиней снижает инфекционную активность вируса ящура, вирус ньюкаслской болезни — вируса везикулярного стоматита и т. д.
Получение первично-трипсинизированных культур клеток из кожномышечной ткани развивающихся куриных эмбрионов.
Куриные эмбрионы 9—11-дневной инкубации овоскопируют. Отбирают яйца с подвижными эмбрионами и хорошо выраженными сосудами. На скорлупе простым карандашом отмечают границы воздушной камеры и расположение зародыша.
Поверхность скорлупы протирают йодированным спиртом и обжигают. Стерильными ножницами срезают скорлупу на 2—3 мм выше границы воздушной камеры, разрывают подскорлупную и хорионаллантоисную оболочки и за шейку извлекают эмбрион в стерильную чашку Петри. У эмбриона удаляют голову, лапки, крылья и внутренние органы. Оставшийся кожномышечный мешок переносят в стерильную майонезную банку (250 мл) и измельчают ножницами на кусочки 3—4 мм.
Измельченную ткань 2—3 раза отмывают раствором Хенкса от слизи и кровяных элементов до получения прозрачных сливных вод и переносят в колбу для трипсинизации. В колбу наливают 0,15%-ный раствор трипсина, подогретого до 35—37 °С (соотношение ткани и трипсина 1 : 3), вносят стерильный магнитик и ставят на магнитную мешалку
Трипсинизацию проводят дробно, т. е. через каждые 3—5 мин отделившиеся клетки вместе с трипсином сливают в центрифужные флаконы и помещают на лед или в холодильник для прекращения действия трипсина на клетки. К оставшемуся в колбе содержимому добавляют новую порцию трипсина. Скорость вращения на магнитной мешалке регулируют так, чтобы не было пены. Процесс повторяют несколько раз (3—5) до полного истощения ткани.
После трипсинизации суспензию клеток в растворе трипсина центрифугируют при 1000 мин-1 10 мин, надосадочную жидкость сливают (выбрасывают), а осадок клеток ресуспендируют в теплой (37 °С) питательной среде (в заведомо известном объеме) и фильтруют через 3-слойный марлевый фильтр.
После тщательного перемешивания клеток берут 1 мл для подсчета клеток.
Успех культивирования клеток в значительной степени зависит от посевной дозы. При малом количестве клеток не наблюдается образование монослоя даже при длительном культивировании. При слишком большой дозе клеток происходит интенсивная их пролиферация, и образованный слой клеток значительно раньше подвергается старению и неспецифической дегенерации. Клетки подсчитывают в камере Горяева.
К 1 мл взвеси клеток добавляют равный объем 0,1%-ного раствора кристаллвиолета, приготовленного на 0,1 н. растворе лимонной кислоты. После перемешивания камеру заполняют взвесью клеток и подсчитывают все клетки, имеющие ядро и неповрежденную цитоплазму; группу клеток с явными контурами считают за одну клетку.
На основании подсчета клеток в двух камерах высчитывают среднее арифметическое в одной из них. Число клеток в 1 мл суспензии (X) определяют по формуле
Х**(А:2- 1000): 0,9,
где А — среднее число клеток в одной камере; 2 — коэффициент разведения суспензии краской; 1000 — число мм3 в 1 см3; 0,9 — объем камеры Горясва, мм3.
После подсчета суспензию клеток разводят питательной средой с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось от 700 тыс. до 1 млн клеток (для куриных фибробластов).
Пример. В 1 мл полученной суспензии клеток (100 мл) содержится 4 млн клеток. Следовательно, всего в 100 мл суспензии 400 млн клеток. Посевная концентрация — 1 млн клеток в 1 мл. Исходную суспензию клеток (100 мл) доводят ростовой питательной средой до 400 мл.
Затем суспензию разливают в матрасы или пробирки. В пробирки заливают по 1 мл, в матрасы вместимостью 1000, 250 и 100 мл вносят соответственно 100, 40 и 15 мл взвеси клеток. Сосуды и пробирки плотно закрывают стерильными резиновыми пробками (для предупреждения защелачивания среды), делают надпись (вид культуры клеток и дату). На пробирках восковым карандашом проводят продольную черту, укладывают их чертой вверх в лотки с наклонным углом 5° и помещают в термостат при 37 °С.
Ежедневно культуры просматривают под малым увеличением микроскопа для определения характера роста. Если клетки не пролиферируют, выглядят округлыми, зернистыми, темными и отслаиваются от стекла, это свидетельствует о плохой обработке посуды или токсичности сыворотки, питательной среды. Пролиферирующие клетки светлые, связаны цитоплазматическими отростками, растут однослойным пластом. В процессе размножения клеток выделяются продукты обмена веществ, которые вызывают изменение рН питательной среды в кислую сторону (среда желтеет), что отрицательно влияет на клетки и может привести их к гибели. Такую среду заменяют свежей. Обычно сплошной монослой куриные фибробласты образуют через 36—48 ч.
От одного куриного эмбриона получают 70—120 млн клеток. Культуры клеток куриных фибробластов используют при работе с вирусом болезни Ауески, оспы птиц, ньюкаслской болезни, гриппа птиц, вируса саркомы Рауса и др.
Список литературы
1. Р.В. Белоусова, Э.А Преображенский, И.В. Третьякова "Ветеринарная вирусология" - М.: КолосС, 2007г.
2. В.Н.Сюрин, Р.В.Белоусова, И.В.Фомина "Ветеринарная вирусология" - М.: ВО " Агропромиздат", 1991г.
3. Р.В.Белоусова, Н.И.Троценко,Э.А.Преображенская "Практикум по ветеринарной вирусологии" - М.: КолосС, 2006г.