Весь полный комплекс мер по умножению количества индивидуального белка иной раз оказывается столь эффективным, что чужеродный белок в цитоплазме бактерий-рециплиентов появляется в ходе их размножения в виде гранул. Он ведь чужой — и потому не расходуется в самой бактерии. После лизиса клеток гранулы можно собрать простым центрифугированием. Для их диссоциации приходится использовать обработку осадка щелочью, детергентами и мочевиной. Белок денатурируется. Для его ренатурации приходится прибегать к разбавлению, диализу от денатурирующих добавок, изменению рН и ионной силы среды.
Подлинность наработанного белка проверяют по ферментативной активности, если он должен таковой обладать. Или же по электрофорезу — сравнением с контрольным препаратом. Но надежнее — одним из иммунологических методов контроля, с которыми мы познакомимся в свое время.
2. Электрофорез
Метод электрофореза таит в себе массу «подводных камней», отчего слепое копирование описанных в научной литературе примеров его использования приводит, как правило, к плачевным результатам. Поэтому попробуем разобраться в физических основах метода поглубже..
2.1 Введение в метод электрофореза
Представим себе два емких сосуда, соединенных между собой тонкой и длинной стеклянной трубочкой, наподобие буквы Н. Пусть сосуды и трубочка заполнены слабым раствором поваренной соли. В сосуды опустим электроды — проволочки, соединенные с клеммами источника постоянного напряжения. К примеру, пусть проволочка из правого сосуда присоединена к клемме «-», а из левого — к клемме «+». Это будут, соответственно, наши катод и анод. Включим напряжение. Миллиамперметр источника покажет, что в замкнутой цепи протекает некий ток. Он течет через солевой раствор, в частности и вдоль трубочки. Она-то нас и интересует. Вдумаемся в то, что в ней будет происходить. Никаких других растворенных веществ в трубочке нет. Электрический ток обусловлен исключительно движением двух ионов — отрицательными ионами Сl и положительными Na+. Первые движутся влево, к аноду, вторые — вправо, к катоду.
Следует ли опасаться, что запас ионов С1- и Na+ в трубочке со временем истощится? Нет. Потому что из резервуара катода в трубочку будут входить ионы Сl-, а из резервуара анода — ионы Na+, поддерживая неизменной концентрацию обоих ионов в ней. Во всяком случае так будет продолжаться до тех пор, пока не исчерпаются или хотя бы существенно изменятся запасы этих ионов в самих резервуарах. Мы до этого доводить не будем.
Зададимся теперь наивным вопросом: а что заставляет какой-нибудь конкретный ион (пусть С1-), находящийся в трубочке, двигаться влево по направлению к аноду? Ответ очевидный _ электрическое поле. А конкретнее?
Раз по трубочке течет электрический ток, значит она играет роль проводника и, следовательно, на нее подается определенное «напряжение». Ну а откуда, спросим себя, некий индивидуальный ион С1-, находящийся в середине трубки «знает», что к ее концам приложено напряжение? Но коль скоро к концам любого проводника приложено напряжение, то в этом проводнике на всей его длине немедленно образуется электрическое поле. Оно будет тем интенсивнее (сильнее), чем больше напряжение и короче трубочка. Величину интенсивности электрического поля в любой точке однородного проводника определяют как Е = V/1, где V _ напряжение, которое подается на проводник, а 1 — его длина. Эту величину именуют «напряженностью» электрического поля в данной точке проводника. Единицей напряженности, очевидно, является В/см.
Величину напряженности поля и «чувствует» любой ион, находящийся в этой точке, она заставляет его двигаться к соответствующему электроду. В однородном проводнике напряженность поля одинакова в любой точке. Подчеркнем, что напряженность поля не зависит (практически) от находящихся в трубочке в малых количествах веществ, хотя бы тоже ионов. Ее определяют основные носители тока, данном случае ионы С1- и Na+. Но сами эти «посторонние» вещества, если они тоже ионы, будут в полной мере испытывать воздействие электрического поля.
Сила, действующая на любой ион равна произведению величины его заряда на напряженность поля. В нашей трубочке она постоянна и мы могли бы ожидать на основе законов механики, что все ионы движутся равноускоренно. Этого не происходит из-за сопротивления, которое оказывает такому движению окружающая среда, в данном случае вода. В результате каждый заряженный ион будет «пробиваться», мигрировать к своему аноду довольно медленно и с постоянной скоростью, поскольку сила трения увеличивается с увеличением скорости миграции до тех пор, пока она не сравняется с силой, влекущей ион к его электроду. У разных ионов эта скорость может быть различной, поскольку сила трения зависит еще и от размера иона. Вообще, скорость миграции иона будет тем больше, чем больше его заряд и напряженность электрического поля и чем меньше размер иона. Ионы С1- и Na+ примерно одинаковой величины и потому мигрируют в разных направлениях, но с примерно одинаковой скоростью. Совсем другое дело, если бы вместо NaCI мы растворили в воде знакомый нам Трис-НСl буфер. Нам известно, что при исходной концентрации Триса =0,1 M и добавлении в его водный раствор НС1 до 0,05 М (при рН8) примерно половина молекул Tpиca превращаются в ионы Трис+ и точно такое же количество в растворе появляется ионов С1-. Ион Трис+ в 3 раза тяжелее и в несколько раз крупнее, чем ион С1-. Соответственно он будет медленнее мигрировать в электрическом поле. А следовательно, основными носителями тока в этом случае будут ионы С1- (хотя свой небольшой вклад дадут и ионы Трис+). Более того, если бы мы вообще каким-либо образом «перегородили дорогу» ионам Трис+, то весь ток переносили бы только ионы С1- (подобно электронам в металлическом проводнике). Напряженность поля установится и прочие заряженные вещества смогут двигаться в этом поле в соответствии со своими зарядами и размерами. Можно сказать, что напряженность поля определяется основными носителями заряда — они создают реальное сопротивление проводника, следовательно и величину напряжения от источника тока, которое приходится на его долю. А тем самым и напряженность поля, если длина проводника (трубочки) неизменна и он однороден.
2.2 Электрофорез белков (общие положения)
Теперь предположим, что с помощью пипетки с отогнутым концом мы ввели в начало трубочки, заполненной Трис-НСl буфером смесь различных молекул белка. Мы знаем, что каждая молекула белка может быть положительно или отрицательно заряжена. Этот заряд определяется как сумма электрических зарядов боковых групп аминокислот: основных (лизин, аргинин, гистидин) и кислых (аспарагиновая и глутаминовая кислоты), лежащих на поверхности белка. Боковые группы, спрятанные внутри белковой глобулы, своего вклада в суммарный заряд белка не дают, так как не соприкасаются с водой и потому не ионизированы.
Начнем рассмотрение с наиболее распространенных кислых белков, т. е. таких, чьи суммарные заряды отрицательны, хотя степень их кислотности, наверное, будет разной — она зависит от соотношения числа заряженных групп разных знаков на поверхности.
Под действием того же самого электрического поля такие белки, подобно иону Сl- будут мигрировать в сторону анода. Они тоже будут испытывать сопротивление своему движению и наверняка большее, чем ион С1- в силу своих размеров и необходимости раздвигать лежащие на их пути молекулы воды.
Когда электрические силы, влекущие молекулы белков к аноду, станут равными силам сопротивления (последние тем больше, чем быстрее движение), скорости миграции белков тоже станут постоянными и, скорее всего, разными у различных белков. Эти скорости будут пропорциональны величинам суммарных зарядов каждого из белков и, разумеется, напряженности общего для них всех электрического поля. Напряженность поля зависит от электропроводности буфера, т. е. концентрации основных носителей тока (в нашем примере — ионов С1-). Присутствие белков, несмотря на их заряды, существенного влияния на электропроводность раствора иметь не должно ввиду малости их количества. Зато величины зарядов белков (а значит и скорости их миграции) будут весьма существенно зависеть не только от их природы, но и от величины рН раствора, создаваемого буфером. Собственно говоря, именно ради того, чтобы иметь возможность управлять зарядами белков, мы заменили в нашем растворе соль на буфер. Создаваемое им рН надо выбрать не так, чтобы все белки получили максимально возможный отрицательный заряд (например, в сильно щелочном буфере). Это невыгодно. Все белки будут двигаться с максимальными скоростями, не сильно отличающимися друг от друга. Выгодно выбрать умеренно щелочную среду и сыграть, таким образом, на различии соотношений основных и кислых боковых групп аминокислот на поверхности разных белков. Иными словами, добиваться максимального различия сил, действующих на разные белки — тогда на своем пути вдоль трубки они разойдутся наиболее явным образом. (Обычно для кислых белков выбирают величину рН8-8,5, а для щелочных, — гистонов, белков рибосом, — используют буферы с рН4—5. Эти последние белки будут мигрировать к катоду.)
О том, как мы будем обнаруживать и трактовать расхождение белков в геле речь впереди. А пока продолжим разговор о выборе буфера. Выше шла речь о выборе его рН. А как выбрать концентрацию буфера? Чем она выше, тем больше, как говорят, «емкость» буфера — его способность удерживать рН раствора от резких изменений при внесении в него кислот и щелочей. Но ведь мы, как будто, не собираемся их вносить? Оказывается вносим! С самими белками.