Полимеразная цепная реакция и электрофорез (стр. 3 из 3)

Вернемся теперь к белкам в электрофорезе. Мы их вносили в трубочку, очевидно, уже растворенными в выбранном для них буфере. Раствор этот был более или менее разбавленным. В ходе электрофореза белки, как мы увидим ниже, будут собираться в узкие зоны, где концентрация каждого из них окажется гораздо выше чем изначально. Вот там-то емкости буфера может не хватить, рН раствора может измениться. За ним изменится и суммарный заряд белка, а следовательно и скорость миграции белковой зоны. Устранить эту опасность, на первый взгляд, легко. Достаточно в несколько раз увеличить концентрацию буфера. Но это будет означать, к примеру для Трис-НСl буфера, такое же увеличение концентрации ионов С1^-. А значит и увеличение силы тока и, как следствие, усиление разогрева жидкости в трубочке. В результате чего возникнут искажения картины разделения белков. Хотя бы потому, что температура жидкости в центре трубочки будет выше, чем у ее стенок. Но ведь можно уменьшить напряжение на клеммах источника. Но это приведет к падению напряженности поля и соответствующему замедлению миграции белков. Что нежелательно ввиду диффузного размытия областей (полос) миграции. В порядке компромисса выбирают обычно молярность буфера в пределах 0,1-0,2М.

Нежелательная ситуация может легко возникнуть и в том случае, когда рН рабочего буфера выбрана близ границы буферной области (см. гл. 2, § 1). Здесь буферная емкость мала по определению. И потому вышеописанный эффект изменения рН в зоне концентрации белка может быть особенно опасен.

Вполне возможно, что столкнувшись с такими трудностями экспериментатору придется отказаться от первоначально выбранного буфера и заменить его на другой, с менее подвижными ионами.

Я не собираюсь приводить здесь практические рецепты. Мне только хотелось показать, что выбор буфера для электрофореза дело тонкое, требующее вдумчивой оценки данной конкретной ситуации.

Теперь обратимся к другой стороне проблемы. До сих пор мы рассматривали только равновесие электрических сил, действующих на белки и сил трения в жидкости. Размер частиц в этом случае может сказываться двояко. С одной стороны будет увеличиваться сила трения в водной среде, но, с другой стороны, может увеличиться и суммарный электрический заряд на поверхности белковой глобулы. Попробуем различие размеров разных белков использовать более определенным образом. Для этого создадим помимо трения о жидкость еще и дополнительное трение — напрямую связанное с размерами мигрирующих молекул белка. Создадим искусственные преграды для миграции в виде пространственной сетки, ячейки которой будут соизмеримы с размерами белков. Эта сетка должна быть образована волокнами, которые надежно смачивает вода, коль скоро мы будем работать в водных растворах. В этом случае буфер будет заполнять ячейки сетки целиком. Хорошо бы, чтобы в нашем распоряжении была возможность выбирать размеры ячеек или пор этой сетки — в зависимости от диапазона размеров белков, которые мы собираемся разделять. Очевидно, что все молекулы белков должны иметь возможность проходить через поры, ни в коем случае не застревать в них. Но проходя, они должны постоянно сталкиваться с образующими поры нитями, что будет тормозить их миграцию в электрическом поле. И чем крупнее белки, тем чаще им придется испытывать эти столкновения, тем «труднее« и медленнее они будут мигрировать. Самые мелкие белки, напротив, будут проходить через поры едва касаясь их нитей. Скорость миграции для белков различной величины, опять-таки, установится постоянной, поскольку статистически постоянным будет эффект столкновения с нитями — он зависит только от соотношения размеров молекул белка и пор. Мы получаем мощное средство разделения белков по их размерам.

Таким образом, выбирая пористость сетки и оценивая результаты разделения белков придется принимать во внимание не только их массу, но и конфигурацию. Мало того, придется учитывать и жесткость (плотность упаковки) белковой молекулы. Рыхлые глобулярные (и особенно фибриллярные) белки могут деформироваться при взаимодействии с сеткой и тем самым облегчать себе миграцию между ее нитями.

Но что же это за сетка, которую мы хотим создать? И как это сделать? Скорее всего это будет гель, подобный пищевому желе, которое получают очень небольшой добавкой желатина к фруктовому соку, или нечто похожее на уже знакомый нам агар. Прежде, чем поговорить об этом геле подробнее, отметим, что благодаря силам смачивания жидкость из геля с достаточно мелкими порами не будет вытекать, даже если она составит 95% его массы. А это значит, что заполнив нашу трубочку гелем, мы можем поставить ее вертикально, как это показано на рис. 36. Кстати сказать, так и выглядели первые приборчики для электрофореза.

Рис. 36

Вертикальное расположение трубочки с гелем сразу обнаруживает одно существенное преимущество. Теперь препарат исходной смеси белков можно наносить тонким ровным слоем на верхнюю поверхность геля. В результате чего и разделяющиеся в ходе миграции в электрическом поле белки будут двигаться вниз в виде тонких дисков. (Каждый со своей скоростью, постепенно располагаясь на всей длине трубочки.)

Разумеется, буферы верхнего и нижнего резервуаров должны смачивать оба торца геля в трубочке. Поэтому гель не должен заполнять трубочку до самого верху, оставляя место для нанесения препарата. В исходную белковую смесь (тоже растворенную в буфере) можно добавить 5-10% сахарозы или глицерина. В таком виде ее можно вносить в трубочку пипеткой с оттянутым полиэтиленовым наконечником, осторожно подслаивая под буфер, находящийся в трубочке.

В ходе электрофореза зоны растворенных белков остаются невидимыми. Для наблюдения за процессом разделения в исходный препарат добавляют 0,01% красителя, молекулы которого несут на себе электрический заряд того же знака, что и фракционируемые белки, но не взаимодействуют с ними. Краситель в электрическом поле перемещается вдоль трубочки в виде окрашенной полоски. Его подбирают таким образом, чтобы скорость его миграции была немного больше, чем скорость наиболее подвижных молекул белка. Когда окрашенная полоска доходит до конца трубочки электрофорез прекращают. В качестве отрицательно заряженного красителя широко используют «Бромфеноловый синий». Для электрофореза щелочных, положительно заряженных белков — «Метиловый зеленый» или «Пиронин».

После окончания электрофореза столбик геля извлекают из трубочки, фиксируют в конечном положении миграции и белки окрашивают — прямо в геле. К методам такой фиксации и окраски мы еще вернемся, а сейчас надо будет познакомиться с природой самого геля, используемого для фракционирования белков.

Литература

1 Курашвили Л.В., Ковалев К.В. Атерогенные липопротеиды у больных с абдоминальной патологией. Научно-практичеекая конференция, посвященная 140-летию областной больницы им.Н.Н. Бурденко и в честь 110-летия со дня рождения академика Н.Н. Бурденко. Тез.докладов. - Пенза. 1986. - С.101-102.

2 Курашвили Л.В. , Устинова Т.И. Лабораторные тесты в диагностике гипоксических соотояний. Научные чтения в часть памяти академика Н.Н. Бурденко). - Пенза, 1988. С.148-150.

3 Курашвили Л.В., Волков А.С., Прокаева П.А. Коэффициент атерогевности и холестерин в диагностике нарушений липидного обмена. VI Научные чтения памяти академика Н.Н. Бурденко. - Пенза, 1988. - С.165-166.

4 Курашвили Л.В., Савченко Р.П. Метаболизм липидов у больных в терминальной стадии хронической почечной недостаточности // Казанский медицинский журнал. - 1990. - Т.XXI. - N 5. - С.338-340.