Вся полимеразная цепная реакция осуществляется invitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров, комплементарных двум 3'-концам участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка ПЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов. Для осуществления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры.
Полимеразная цепная реакция. Для того чтобы амплифицировать какой-то сегмент ДНК, синтезируют два олигонуклеотидных праймера, каждый из которых комплементарен одному из двух 3'-концов участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. В ходе ПЦР-реакции необходимо копировать последовательность каждой из цепей, находящуюся между участками, с которыми спариваются олигонуклеотидные праймеры. После спаривания праймеров с денатурированной ДНК, содержащей амплифицируемый сегмент, осуществляют встречное удлинение праймеров с помощью ДНК-полимеразы в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Образующиеся дуплексные ДНК денатурируют, вновь спаривают с праймерами и проводят ДНК-полимеразную реакцию. Этот цикл может быть повторен примерно 60 раз с удвоением в каждом цикле количества дуплексного сегмента ДНК. За п циклов образуется 2" копий дуплексного сегмента, ограниченного праймерами.
Используя термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильных бактерий Thermusaquaticus, можно осуществлять множество ПЦР-циклов при однократном введении фермента. Сначала смешивают ДНК, избыточное количество праймерных молекул, дезоксинуклеозидтрифосфаты и полимеразу. Цикл запускают, нагрев смесь до температуры, обеспечивающей денатурацию ДНК; затем охлаждают раствор до температуры, необходимой для отжига праймеров. Далее устанавливают температуру, при которой может происходить синтез ДНК. Весь процесс, который длится несколько часов, можно автоматизировать, используя нагреватели, работа которых регулируется с помощью компьютера.
Использование ДНК-полимеразы Т. aquaticus не только позволяет автоматизировать процесс, но дает и другое преимущество. Этот фермент наиболее активен в температурном интервале 70-75°С. При таких условиях спаривание олигонуклеотидных праймеров и ДНК происходит более специфично, чем при 37°С - оптимальный температуре для ДНК-полимеразы Е. coli. В результате ассоциация праймеров происходит более точно, что сводит к минимуму амплификацию нежелательных сегментов ДНК, особенно в присутствии всей геномной ДНК. Точность отжига повышается также при подборе оптимального температурного режима, ионной силы, длины праймера и его нуклеотидного состава. Специфичность может быть достаточно высокой, чтобы осуществлялась амплификация двух разных сегментов в одном и том же препарате ДНК в присутствии двух пар праймеров.
РНК можно амплифицировать с образованием дуплексной ДНК аналогичным образом с той лишь разницей, что в начале первого цикла необходимо синтезировать кДНК-копию РНК. Если РНК представлена молекулами мРНК, то роль одного из праймеров в ПЦР, а также в реакциях с участием обратной транскриптазы могут выполнять короткие рогу-цепочки.
Разные варианты полимеразных цепных реакций. Как мы уже говорили, для проведения ПЦР необходимо знать нуклеотидные последовательности, фланкирующие амплифицируемый сегмент. Это подразумевает, что ПЦР-метод может применяться только при наличии предварительно клонированных и секвенированных сегментов ДНК. Однако с помощью относительно простых модификаций можно значительно расширить возможности метода ПЦР. В одном из вариантов можно выделить определенный ген, если известна аминокислотная последовательность лишь короткого участка соответствующего очищенного белка. Например, синтезировав праймеры длиной 20 пар нуклеотидов на основании данных о последовательности двух концов пептидного сегмента длиной в 20 аминокислот, можно амплифицировать геномный фрагмент длиной 60 п. н. Вследствие вырожденности генетического кода при этом используют смесь праймеров с альтернативными основаниями в нужных положениях. После проведения ПЦР амплифицированный сегмент из 60 п. н. очищают с помощью гель-электрофореза или клонирования и используют в качестве зонда для идентификации интересующей нас последовательности при анализе библиотек геномной ДНК или кДНК.
Еще один пример универсальности метода ПЦР дает использование его для амплификации полной кДНК-копии мРНК исходя из данных последовательности одного небольшого участка либо соответствующего пептида, либо мРНК. Метод состоит в следующем. Суммарную мРНК копируют с образованием одноцепочечной кДНК, используя короткий рогу^Т) - праймер. Затем с помощью терминальной трансферазы к 3'-концу кДНК присоединяют "хвост"; разд.4.8); используя короткий рогу^С) - праймер, синтезируют вторую цепь ДНК. До этого момента никакой специфичности в отношении определенной мРНК не проявляется. На следующем этапе используют олигонуклеотидный праймер с такой же последовательностью, как и у короткого участка вблизи 3'-конца нужной нам мРНК. С помощью этого праймера и poly проводят ПЦР; специфичность оказывается достаточно высокой для получения практически чистого продукта, представляющего полноразмерную мРНК.
В другом варианте в 5'-концы праймеров включают последовательности, соответствующие какому-либо рестриктазному сайту. При отжиге с исходной матрицей они остаются неспаренными, но амплифицируемый фрагмент приобретает концевые рестриктазные сайты. Они могут оказаться полезными при последующем клонировании или включении в вектор для изучения экспрессии.
Применение ПЦР. Возможности метода ПЦР во всей полноте еще не раскрыты, но с его помощью уже удалось получить новые данные о структуре разных РНК, генов и геномов, а также о процессах, протекающих на геномном уровне. Одно из его очень важных применений состоит в определении характера мутаций. После того как ген клонирован, с помощью двух праймеров амплифицируют соответствующий геномный сегмент, полученный от разных особей данного вида. Секвенирование этого сегмента позволяет установить природу мутации, произошедшей в данном гене, или выявить полиморфизм, будь то замена одной пары оснований или делеция, инсерция или перестройка. Благодаря простоте метода с его помощью можно диагностировать генетические заболевания и проводить популяционно-генетические исследования. Используя праймеры, которые специфически ассоциируются с определенными мутантными формами гена, можно также классифицировать мутации.
С помощью зондов, комплементарных геномам таких инфекционных агентов, как вирусы и бактерии, могут быть идентифицированы геномы этих агентов на фоне значительного избытка ДНК клетки-хозяина. В частности, вполне реальной представляется диагностика СПИДа с помощью этого метода. Еще одно его применение состоит в анализе структуры продуктов реакций рекомбинации.
Одним из интересных и потенциально наиболее эффективных применений ПЦР является амплификация сегментов ДНК внутри отдельных клеток. Такие опыты проводились как на диплоидных клетках, так и на сперматозоидах человека. Использование сперматозоидов имеет особое значение для генетического анализа видов, включая человека, которые не могут подвергаться экспериментальному скрещиванию. Этот метод позволяет оценить частоту мейотической рекомбинации непосредственно в больших популяциях сперматозоидов, если использовать пару праймеров, специфичных в отношении полиморфных или мутантных форм сцепленных генов.