В ходе репликации рост цепи осуществляется благодаря взаимодействию дезоксирибонуклеозидтрифосфата с 3'-ОН концевым нуклеотидом уже построенной части ДНК; при этом отщепляется пирофосфат и образуется фосфодиэфирная связь. Рост полинуклеотидной цепи идет только с ее З'-конца, т. е. в направлении 5' : 3'. Фермент, катализирующий эту реакцию, -ДНК – полимераза.
Энергия, затрачиваемая на образование каждой новой фосфодиэфирной связи в цепи ДНК, обеспечивается расщеплением фосфатной связи между a- и b-фосфатными группами нуклеозидтрифосфата.
ДНК-полимераза имеет один центр связывания нуклеозидтрифосфата, общий для всех четырех нуклеотидов. Выбор из среды нуклеотида, основание которого комплементарно очередному основанию матрицы, протекает без ошибок, благодаря определяющему влиянию ДНК-матрицы (исходной цепи ДНК). При некоторых мутационных повреждениях структуры ДНК-полимеразы в ряде случаев происходит включение некомплементарных нуклеотидов.
В процессе репликации формальной ДНК на короткое время с вероятностью 10-4-10-5 возникают редкие таутомерные формы всех 4 азотистых оснований нуклеотидов, которые образуют неправильные пары. Высокая точность репликации (вероятность ошибок не превышает 10-9) обусловлена наличием механизмов, осуществляющих коррекцию (репарацию).
Репликационная вилка асимметрична. Из двух синтезируемых дочерних цепей ДНК одна строится непрерывно, а другая – с перерывами. Первую называют ведущей, или лидирующей, цепью, а вторую – отстающей. Синтез второй цепи идет медленнее; хотя в целом эта цепь строится в направлении 3' : 5', каждый из ее фрагментов в отдельности наращивается в направлении 5' : 3'. Благодаря такому прерывистому механизму синтеза, репликация обеих антипараллельных цепей осуществляется с участием одного фермента-ДНК-полимеразы, катализирующего наращивание нуклеотидной цепи только в направлении 5' : 3'.
В качестве затравок для синтеза фрагментов отстающей цепи служат короткие отрезки РНК, комплементарные матричной цепи ДНК. Эти РНК-затравки (праймеры), состоящие примерно из 10 нуклеотидов, с определенными интервалами синтезируются на матрице отстающей цепи из рибонуклеозидтрифосфатов в направлении 5' : 3' с помощью фермента РНК-праймазы. РНК-праймеры затем наращиваются дезоксинуклеотидами с 3'-конца ДНК-полимеразой, которая продолжает наращивание до тех пор, пока строящаяся цепь не достигает РНК-затравки, присоединенной к 5'-концу предыдущего фрагмента. Образующиеся таким образом фрагменты (т. наз. фрагменты Оказаки) отстающей цепи насчитывают у бактерий 1000-2000 дезоксирибонуклеотидных остатков; в животных клетках их длина не превышает 200 нуклеотидов.
Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5' : 3'-экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З'-конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З'-ОН нового фрагмента ДНК и 5'-фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамид-адениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов).
Раскручивание двойной спирали и пространств. разделение цепей осуществляется при помощи нескольких специальных белков. Геликазы расплетают короткие участки ДНК, находящиеся непосредственно перед репликационной вилкой. На разделение каждой пары оснований расходуется энергия гидролиза двух молекул АТФ до аденозиндифосфата и фосфата. К каждой из разделившихся цепей присоединяется несколько молекул ДНК-связывающих белков, которые препятствуют образованию комплементарных пар и обратному воссоединению цепей. Благодаря этому нуклеотидные последовательности цепей ДНК оказываются доступными для репликативной системы. Другие специфические белки помогают праймазе получить доступ к матрице отстающей цепи. В результате праймаза связывается с ДНК и синтезирует РНК-затравки для фрагментов отстающей цепи. Для формирования новых спиралей не требуется ни затрат энергии, ни участия комплементарного "закручивающего" фермента.
В случае кольцевого репликона (напр., у плазмиды) описанный процесс наз. q-репликацией. Кольцевые молекулы ДНК закручены сами на себя (суперспирализованы), при раскручивании двойной спирали в процессе репликации они должны непрерывно вращаться вокруг собственной оси. При этом возникает торсионное напряжение, которое устраняется путем разрыва одной из цепей. Затем оба конца сразу же вновь соединяются друг с другом. Эту функцию выполняет фермент ДНК-топоизомераза. Репликация в этом случае обычно происходит в двух направлениях, т.е. существуют две репликационные вилки. После завершения репликации появляются две двухцепочечные молекулы, которые сначала связаны друг с другом как звенья одной цепи. При их разделении одно из двух колец временно разрывается.
Альтернативный вариант репликации кольцевого репликона предполагает разрыв в одной из цепей двухспиральной молекулы ДНК. Образовавшийся при этом свободный 3'-конец ковалентно наращивается, оставаясь связанным с матрицей (второй, неразорванной цепью), а 5'-конец постепенно вытесняется новой полинуклеотидной цепью. Таким образом одна цепь разматывается и непрерывно удлиняется, а репликационная вилка скользит вокруг кольцевой матричной цепи (механизм "катящегося кольца"). По мере роста новой цепи вытесненная цепь с освободившимся 5'-концом становится линейной матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Этот синтез на линейной матрице продолжается до тех пор, пока не образуется дочерняя цепь ДНК, комплементарная одному обороту кольцевой матрицы, т. е. целому репликону. Таким путем с кольцевой матрицы может сходить большое число комплементарных копий. Такой механизм обнаружен у некоторых вирусов, а также в ряде клеток эукариот.
Еще одна схема репликации предполагает формирование структуры, названной D-петлей. Согласно этому механизму, сначала реплицируется только одна из цепей кольцевого репликона, тогда как вторая цепь, оставаясь интактной, вытесняется, образуя петлю. Репликация второй цепи начинается с др. стартовой точки и только после того, как реплицировалась часть первой цепи. Такой механизм репликации обнаружен, например у митохондриальных ДНК.
Репликация РНК (синтез РНК на РНК-матрице) изучена меньше. Она осуществляется только у некоторых вирусов (напр., у вирусов полиомиелита и бешенства). Фермент, катализирующий этот процесс – РНК–зависима РНК–полимераза (его называют также РНК-репликазой или РНК-синтетазой). Известно несколько типов репликации, РНК:
1. вирусы, содержащие матричные РНК, или мРНК [т. наз. (+)РНК], в результате репликации образуют комплементарную ей цепь [(-)РНК], не являющуюся мРНК, которая используется как матрица для синтеза (+)РНК;
2. вирусы, содержащие (—)РНК, в результате репликации синтезируют (+)РНК;
3. вирусы, содержащие двухцепочечную РНК [(+)PHK и (—)РНК], в результате асимметрической репликации синтезируют (+)РНК.
Гипотеза о механизме репликации сформулирована в 1953 Дж. Уотсоном и Ф. Криком, которые предположили, что две комплементарные цепи ДНК после их разделения могут выполнять функции матриц для образования на них новых цепей ДНК. В 1958 М. Мезельсон и Ф. Сталь экспериментально подтвердили такой механизм репликации.
3. Основные ферменты репликации ДНК
ДНК – полимераза
ДНК-полимераза — фермент, участвующий в репликации ДНК. Ферменты этого класса катализируют полимеризацию дезоксирибонуклеотидов вдоль цепочки нуклеотидов ДНК, которую фермент «читает» и использует в качестве шаблона. Тип нового нуклеотида определяется по принципу комплементарности с шаблоном, с которого ведётся считывание. Собираемая молекула комплементарна шаблонной моноспирали и идентична второму компоненту двойной спирали.
Выделяют ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, использующую в качестве матрицы одну из цепей ДНК, и РНК-зависимую ДНК-полимеразу, способную также к считыванию информации с РНК (обратная транскрипция).
ДНК-полимеразу считают холоферментом, поскольку для нормального функционирования она требует присутствия ионов магния в качестве кофактора. В отсутствии ионов магния о ней можно говорить как об апоферментe.
ДНК-полимераза начинает репликацию ДНК, связываясь с отрезком цепи нуклеотидов. Среднее количество нуклеотидов, присоединяемое ферментов ДНК-полимеразой за один акт связывания/диссоциации с матрицей, называют процессивностью.
ДНК – лигазы
Лигаза — фермент, катализирующий соединение двух молекул с образованием новой химической связи (лигирование). При этом обычно происходит отщепление (гидролиз) небольшой химической группы от одной из молекул.