Репликация различных ДНК, ее регуляция и репарация (стр. 2 из 3)

рибонуклеаза Н

ДНК-полимеразаII

Рис. 28

Тем временем в районе образования уже третьей вершины вилки редупликации происходят точно такие же события, как на 2-м этапе редупликации. Скорость этого процесса оценивается как, примерно, 1000 нуклеотидов в секунду у бактерий 100 — у животных и 20 — у растений.

Весьма вероятно, что в то же самое время аналогичные процессы расплетания двойной спирали с образованием фрагментов Оказаки и комплементарного построения новых нитей ДНК идут и с противоположного конца материнской ДНК. Разумеется, там ДНК-полимераза III непрерывно двигается вдоль той нити ДНК, которую мы назвали 2-й, а на фрагменты Оказаки разрезается 1-я нить. Когда два движения встречаются, две дочерние копии исходной ДНК оказываются готовы. (Их «сошьет» все та же лига-за.) Кстати оказалось, что длина фрагментов Оказаки у E.coli (1—2 тысячи нуклеотидов) значительно больше, чем у эукариотов (меньше 200). Не лишено интереса совпадение этой последней цифры с длиной ДНК в нуклеосоме (см. ниже).

Более сложная модель движения репликативной вилки предполагает формирование реплисомы – мультиферментного комплекса более высокого уровня организации. Этот комплекс состоит из функционального праймосомо-праймазного комплекса, геликазы, полимеразы III, и, возможно, гиразы. Такой комплекс может обеспечивать удлинение лидирующей цепи и одновременно инициацию праймерной РНК, а также достраивание ДНК при синтезе отстающей цепи. Две реплисомы, работающие согласованно в двух вилках репликации, которые движутся в противоположных направлениях вдоль кольцевой хромосомы, сделали бы эту модель еще более изящной.

Репликация кольцевых дуплексов. Репликация инициируется также в точке начала репликации (ori).

Растущие цепи образуют репликативные вилки, пересещающиеся либо в двух (вверху), либо в одном (внизу) направлении в зависимости от природы точки начала репликации.

В некоторых кольцевых геномах в каждой цепи имеется своя точка начала репликации (например, в митохондриальной ДНК животных ). Синтез одной цепи начинается в точке ori_R. Когда новая цепь доходит до точки ori_D, начинается синтез другой цепи. Синтез инициируется путем образования праймерной РНК.

Некоторые двуцепочечные кольцевые хромосомы реплицируются альтернативным способом, называемым репликацией по типу катящегося кольца. В этом случае двуцепочечная кольцевая ДНК надрезается специфическим ферментом в уникальном сайте одной цепи (точке начала катящегося кольца), и к образовавшемуся в результате надреза 3΄ - гидроксильному кольцу с помощью полимеразы III присоединяются нуклеотиды; при этом матрицей служит интактная замкнутая цепь. Таким образом в вилке синтезируется только лидирующая нить. По мере синтезалидирующей цепи происходит вытеснение 5΄-конца надрезанного кольца как одиночной цепи. В результате длина лидирующей цепи может превышать длину матрицы в 2-5 раз. Такой способ репликации используют фаги М13 или фX174 (их зрелые геномы одноцепочечные кольцевые ДНК)на поздних стадиях инфекционного процесса, после того как инфицирующая ДНК превращается в двуцепочечную кольцевую форму. Постоянно отделяющиеся одиночные цепи ДНК, образуемые при репликации по типу катящегося кольца, надрезаются в каждой точке начала репликации и замыкаются с образованием зрелых форм, упаковываемых в вирусные частицы. Фаг λ использует такой способ репликации при образовании двуцепочечной линейной вирусной ДНК. Субстратной матрицей в этом случае является двуцепочечная кольцевая ДНК, которая была реплицирована после превращения на ранних этапах инфекции линейной вирусной ДНК в кольцевую репликативную форму.

Что до механизма редупликации у эукариотов, то, хотя он изучен хуже, тем не менее и здесь найдены и охарактеризованы целых пять ДНК-полимераз, которые принято обозначать греческими буквами: α, β, γ, δ, и ε. Основным ферментом, подобным ДНК-полимеразе III у бактерий, является ДНК-полимераза δ. ДНК-полимераза α отвечает за построение праймеров (из рибонуклеотидов). ДНК-полимераза β — копирует фрагменты Оказаки и отвечает за репарацию ДНК. ДНК-полимераза γ ведет синтез ДНК в митохондриях. Функция ДНК-полимеразы ε пока неизвестна.

Конечно, гигантские ДНК высших организмов начинают редупликацию не только с концов молекулы, но и во множестве промежуточных точек. Считают, что у дрожжей таких точек начала репликации около 300. Они отстоят друг от друга на 40 тысяч пар нуклеотидов. В ДНК человека насчитывают до 20 000 точек начала, расположенных с интервалом в 150 тысяч пар нуклеотидов. По-видимому, местами начала расплетания и посадки ДНК-полимеразы δ служат последовательности относительно слабо связанных А—Т пар оснований. После инициации репликация продолжается в двух направлениях от каждой точки до тех пор пока репликативные вилки двух соседних точек начала репликации не сольются. Полноразмерные ДНК каждой дочерней хромосомы получаются путем соединения более коротких независимо инициированных новосинтезированных цепей.

Теломеры и центромеры. Центомеры и теломеры – наиболее четко выраженные морфологические структуры хромосом (прозрачка 12). Долгое время считалось, что их строение и функции связаны с какими-то особенными последовательностями ДНК. Однако удалось выявить лишь одну такую особенность на молекулярном уровне: присутствие в области центромер и теломер сателлитной ДНК. Сателлитная ДНК – это длинные тандемные повторы, расположенные в области центромер и теломер.

Строение центромер. У млекопитающих центромеры имеют сложную дискообразную структуру, называемую кинетохором. С каждой стороны хромосомы располагается по одному кинетохорному диску. Во время митоза микротрубочки фибрилл веретена деления прикрепляются непосредственно к плотному наружнему слою кинетохора, связанному с петлями хроматина. Кинетохор у дрожжей образуют CEN-области (короткие сегменты ДНК) вместе с ДНК-связывающими белками (прозрачка 13). Последовательности, расположенные с одной или с обеих сторон от CEN-областей, могут блокировать прохождение репликационной вилки до появления специфического сигнала, разрешающего окончание репликации в анафазе.в таком случае число хромосом не будет превышать одной на дочернюю клетку.

Последовательности в области теломер. Теломеры –концы эукариотической хромосомы, являются также и концами линейного дуплекса ДНК. Именно с теломерами связана одна из проблем репликации: как достраиваются 5΄-концы хромосомного дуплекса, если ДНК-полимеразы не инициируют синтез новых цепей? Возможно, этот вопрос решается также как при репликации линейного дуплекса аденовирусов, или с помощью альтернативных механизмов? Недавно полученные данные свидетельствуют о том, что концевые области эукариотических хромосом – теломеры – реплицируются с помощью особого механизма. Концы хромосом дрожжей, беспозвоночных, растений и позвоночных имеют сходное строение: они содержат шпилькообразные структуры, в которых 3΄- и 5΄-концы дуплекса ДНК оказываются рядом, и много тандемных повторов. Около петли в одной из цепей в области повторов имеются множественные одноцепочечные разрывы. Недавно из Tetrahymena был выделен фермент – теломераза – терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза, которая присоединяет повтор 5΄-TTGGGG-3΄, последовательно по одному нуклеотиду, к 3΄-концам специфических олигонуклеотидных праймеров (TTGGGG)_n (Tetrahymena) и (TGTGTGGG)_n (дрожжи). Таким образом, теломераза может строить теломеры при этом родительская ДНК не используется в качестве матрицы (ппрозрачка 20). Теломераза – это крупный рибонуклеопротеиновый комплекс, а для проявления ферментативной активности требуется как РНК так и белки. Гипотетически схема образования теломеры представлена на рисунке. В верхней части рисунка представлено образование петли на конце цепи, содержащей последовательность 5΄-(TTGGGG)_n-3΄, и одноцепочечных разрывов на противоположной цепи, содержащей последовательность 5΄-(CCCCAA)_n-3΄. К 3΄-концу нижней цепи с помощью телоизомеразы присоединяются последовательно, по одному нуклеотиду, единицы 5΄- TTGGGG -3΄. Праймаза и ДНК-полимераза копируют 5΄- (TTGGGG)_n -3΄-цепь с образование новых 5΄-(CCCCAA)_n-3΄-единиц. В результате неполного лигирования в С-богатой цепи остаются одноцепочечные разрывы. На 3΄-конце 5΄-(TTGGGG)_n-3΄-цепи вновь образуется петля, стабилизируемая взаимодействиями между остатками гуанозина.

Терминация репликации.

Терминация и расхождение в кольцевых геномах. Замкнутость структуры многих геномных ДНК упрощает процесс завершения репликации всей нуклеотидной последовательности. Непрерывный рост лидирующей и отстающей цепи вдоль кольцевой матрицы неизбежно приводит к совмещению 3΄-гидрокси- и 5΄-фосфорильного концов одной цепи либо в точке начала репликации, либо – при двунаправленной репликации – в середине кольца (прозрачка 14). Кольца в этих местах встречи соединяются ДНК-лигазой, при этом они обычно оказываются попарно сцепленными, и в дальнейшем должно произойти их разъединение на отдельные геномы. Это происходит с помощью топоизомеразы типа II (прозрачка 15).