Одним из механизмов регуляции матричной активности хроматина является обратимое ацетилирование гистонов. В ядрах нейронов ацетилирование гистонов более выражено по сравнению с глиальными клетками. Это коррелирует с более высокой активностью эндогенных РНК-полимераз нейронов и с большим числом активных участков инициации транскрипции. С другой стороны, в первые дни постнатального онтогенеза степень ацетилирования гистонов в неокортексе крыс быстро уменьшается.
Обнаружено, что конечная дифференцировка нейронов неокортекса и мозжечка крыс в первые недели постнатального онтогенеза сопровождается изменениями в наборах негистоновых белков хроматина, наиболее примечательным из которых можно считать появление белков - J5 и - 38 кД, имеющих специфическое сродство к однонитчатой ДНК. Свое влияние на матричные процессы они оказывают, способствуя локальному расплетению двойной спирали ДНК.
В ядрах нейронов неокортекса обнаружены также белки, имеющие сродство к специфической левоспиральной форме ДНК - Z-ДНК. В последние годы такие Z-ДНК-связывающие белки привлекают большое внимание как возможные регуляторы транскрипции и других генетических процессов.
При терминальной дифферениировке нейронов происходят также изменения в наборах особой фракции негистоновых белков, прочно связанных с ДНК, некоторые из которых являются мозгоспецифическими.
Важную роль в регуляции транскрипции генов могут играть, наконец, процессы фосфорилирования, метилирования и, возможно, другие посттрансляционные модификации негистоновых белков хроматина. Заметные изменения в наборах фосфорилируемых и метилируемых негистоновых белков наблюдаются в ядрах нейронов и глиальных клеток неокортекса крыс в первые недели постнатального онтогенеза. При этом главное различие между ядрами нейронов и глиальных клеток состоит в большем мешлировании группы специфических для нейронов негистоновых белков - 100 кД. В ядрах нейронов и глии мозга мышей обнаружены протеинкиназная и метилазная активности, значительная часть которых прочно ассоциирована с хроматином.
Протеинкиназа осуществляет цАМФ-независимое фосфорилирование белков хроматина. Ее активность в ядрах нейронов значительно выше, чем в ядрах глиальных клеток. При действии ряда нейромедиаторов на нейроны мозга крыс наблюдается фосфорилирование ядерных белков и стимуляция синтеза РНК. Фосфорилирование части негистоновых белков индуцируется в клетках верхнего шейного ганглия при действии фактора роста нервов. В хромаффинных клетках надпочечников фосфорилирование негистоновых белков хроматина пАМФ-зависимой протеинкиназой является центральным звеном в транссинаптической регуляции синтеза тирозин-3-мо-нооксигеназы ацетилхолином. Показано, что фосфорилирование негистоновых белков хроматина повышается при выработке оборонительных условных рефлексов.
Общее содержание РНК в большинстве нервных клеток очень велико. Среднее отношение РНК: ДНК достигает 50 и сравнительно редко бывает ниже 3. Это превышает отношение, характерное для особенно интенсивно метаболирующих клеток секреторных тканей, где оно составляет 2-4,5. В мотонейронах головного мозга и в спинальных ганглиях количество РНК в одной клетке достигает 500-2500 пг. Такое обилие РНК обусловлено главным образом наличием мощного рибосомального белоксинтезирующего аппарата в цитоплазме нейрона. Быстро обменивающаяся мессенджер-РНК, тоже относительно широко представленная в нейронах, занимает в количественном отношении скромное место по сравнению с рибосомальной РНК.
Рибосомальная РНК мозга и аппарат трансляции не имеют принципиальных отличий от других тканей и органов. Поэтому, отметив особую мощность последнего, сосредоточим далее внимание на особенностях синтеза и многообразии мРНК мозга, обусловливающих качественное своеобразие белков и многих других компонентов нервных клеток.
Так же как и во всех дифференцированных клетках и тканях организма, в нейронах и глиальных клетках мозга "работает" лишь часть генов. Это, с одной стороны, гены, ответственные за продукцию белков, необходимых для обеспечения метаболических процессов, более или менее сходных в разных клетках и тканях, а с другой стороны, гены, участвующие в синтезе белков, регулирующих специфические функции данной ткани. Активность остальных генов, не нужных для функций данных клеток, подавлена. Доля активных генов в каждой данной ткани обычно невелика - менее 10% - и неодинакова в разных клетках и тканях. В мозге эта доля выше, чем в других органах, что отражает особую сложность его функций. К сожалению, точные значения этих параметров пока не установлены.
В последние годы проводится систематическое исследование характера экспрессии большого числа индивидуальных генов в мозге млекопитающих. Для этого случайно выбранные из коллекции кДНК клонов мозга крысы последовательности гибридизуются с препаратами поли+РНК из разных тканей в так называемых Нозерн блоттах. По результатам гибридизации можно судить о присутствии соответствующих данному клону последовательностей РНК в исследуемых тканях, их количестве, гетерогенности и т.д. Анализ таким методом 191 случайно выбранного клона позволил авторам разбить все экспрессируемые в мозге поли+РНК на четыре класса: I - "нерегулируемые", т.е. одинаково экспрессируемые во всех исследованных тканях и, скорее всего, кодирующие так называемые белки "домашнего хозяйства", необходимые для жизнедеятельности любой клетки; II - регулируемые, т.е. экспрессируемые в клетках всех трех тканей, но в разной степени; III - мозгоспецифические, т.е. экспрессируемые только в клетках мозга; IV - редкие, т.е. присутствующие в мозге в количестве, недостаточном для строго воспроизводимого обнаружения использованным методом. Если считать мозгоспецифическими РНК III и IV классов, в эту категорию попадает более половины синтезируемых в мозге мРНК, что хорошо согласуется с оценками, полученными с помощью методов суммарной ДНК-РНК-гибридизации.
Важно отметить, что определение нуклеотидной последовательности клонированных мозгоспецифических мРНК позволяет воспроизвести аминокислотную последовательность кодируемого белка.
Такой анализ был осуществлен Сатклиффом, например, для одного из клонов, кодирующих РНК III класса. Этот клон гибридизуется с моз-госпецифической мРНК, присутствующей в разных отделах мозга крысы, но в разном количестве. Кодируемый этой РНК полипептид не содержит участков гомологии с ранее изученными белками.
С помощью антител к синтетическим фрагментам этого полипептида изучена его локализация в мозге. Он обнаружен в аксонах, иннервирующих клетки Пуркинье в мозжечке, пирамидные нейроны поля САЗ гиппокампа; в радиальных волокнах глубоких слоев цингулярной и соматосенсорной коры; в группах волокон свода, стриатума, латерального обонятельного тракта и других структур. Источником этих волокон являются нейроны медиального ядра трапециевидного тела, центральной покрышки моста, вентромедиального и базальноаркуатного ядер гипоталамуса, а также нейроны, разбросанные по другим структурам.
Эту работу Сатклиффа и соавторов можно считать образцом технически выполнимой и универсальной методологии поиска новых мозгоспецифических мРНК и исследования первичной структуры, мест синтеза и функциональной роли кодируемых ими мозгоспецифических белков.
Особый интерес в этом отношении представляют мРНК III и IV классов, имеющие ограниченную локализацию внутри мозга и его отдельных структур. Судя по содержанию наиболее редких мозгоспецифических мРНК, они должны транскрибироваться в ограниченных популяциях нервных клеток и, возможно, связаны с узкой функциональной специализацией этих популяций.
Для избирательного клонирования таких РНК в последние годы используют процедуру "вычитания", суть которой заключается в удалении из суммарных препаратов кДНК последовательностей, общих для разных отделов мозга, и последующем клонировании такого "вычтенного" препарата кДНК. Так, уже клонированы мРНК, имеющие ограниченное распространение в неокортексе обезьян, но их изучение еще только начинается.
В лаборатории J.С. Venter начато составление всеобъемлющего каталога генов, экспрессирующихся в мозге человека. Для этого авторы, осуществляют крупномасштабное сиквенирование клонов из библиотек кДНК мозга человека и его частей. К настоящему времени они получили частичные последовательности для примерно 3000 клонов, большинство из которых являются ранее не известными. Ближайшей задачей является картирование соответствующих генов в хромосомах человека и использование полученных данных для идентификации генов, ответственных за различные наследственные заболевания.
Несколько мозгоспецифических клонов из коллекции Сатк-лиффа и соавторов проявляли необычный характер гибридизации с препаратами поли+РНК, узнавая в них общую короткую мозгоспецифическую РНК. Эта малая РНК найдена во всех отделах мозга крыс, хотя и в неодинаковых количествах. Анализ нуклеотидной последовательности нескольких клонов показал, что единственным общим для них элементом является консервативная 82-нуклеотидная последовательность, которая и ответственна за гибридизацию с ВС1 РНК. Инвариантными в этой последовательности являются 51 нуклеотид] еще 24 нуклеотида одинаковы в 90% проанализированных клонов. Справа эта последовательность соседствует с олигонуклеотидами, содержащими в основном остатки аденина. Остальные примыкающие или близкие к ней последовательности в разных клонах совершенно различны. Присутствие одной и той же или сходной нуклеотидной последовательности в разных мозгоспецифических РНК как бы маркирует их, что и послужило основанием для ее обозначения как характеристической seguence"). Эта последовательность присутствует в некодирующих областях многих генов и соответствующих пре-мРНК и в большинстве случаев удаляется при процессинге последних. Ее функция до сих пор неизвестна, хотя есть основания полагать, что она служит неспецифическим стимулятором транскрипции содержащих ее генов. В любом случае ID-последовательность не является нейроспецифическим регулятором транскрипции, поскольку она присутствует и в многих пре-мРНК соматических тканей.