Структура и свойства мембранных липидов (стр. 3 из 4)
2.5. КОНФИГУРАЦИЯ И УПАКОВКА АЦИЛЬНЫХ ЦЕПЕЙ В БИСЛОЕ
Рассмотрим сначала насыщенные углеводородные цепи. В них возможно свободное вращение вокруг каждой С—С-связи, характеризующееся энергетическим минимумом, особенно четким в случае ньюменовской проекции. Наиболее стабильна транс-конфигурация, при этом высота энергетического барьера для перехода через заслоненную конфигурацию в гош-форму составляет по оценкам 3,5 ккал/моль. В полностью m/wwc-конфигурации цепь максимально вытянута и не меняет своего направления, тогда как в гош-конформации ее направление меняется. Последовательность гош-транс-гош для трех смежных С—С-связей приводит к появлению в цепи излома, в результате чего участки цепи выше и ниже места излома оказываются значительно смещенными друг относительно друга. /ош-конфигурация в зависимости от направления вращения при переходе от Qк С4 обозначается как g+ или g". Кинки типа g+tg~ или g~ tg+приводят к минимальному сдвигу цепи. Почти все двойные связи в мембранных липидах находятся в J/ис-конфигурации. Как и в случае гош-конфигурации, это приводит к изменению общего направления цепи. Наличие в углеводородных цепях кинков, двойных ^ыс-связей,
циклопропановых групп и других особенностей приводит к увеличению площади поперечного сечения цепи; это может иметь важные последствия для упаковки липидов в бислое. При этом стерические требования к упаковке углеводородных цепей и полярных головок такие же, как и в липидных крастал-лах. Эти принципы будут обсуждаться в разд. 2.3 при анализе формы мицелл.
Многие методы, включая дифракцию рентгеновских лучей и нейтронов, спектроскопию КР и ИК-спектрометрию, указывают, что в фазе геля насыщенные углеводородные цепи фосфолипидов находятся преимущественно в полностью-гпрднс-конфигурации. Минимальная площадь поперечного сечения молекулы диа-цильного фосфолипида равна около 38 A2. Примерно такую площадь занимает полярная головка фосфатидилэтанола-мина, поэтому насыщенные фосфатидилэтаноламины в гелевой фазе упаковываются так, что ацильные цепи располагаются перпендикулярно плоскости бислоя, как и в липидных кристаллах. В случае же кристаллов фосфатидилхолина минимальная площадь, приходящаяся на одну полярную головку, составляет примерно 50 А2. Поэтому дипальмитоилфосфатидилхолин в гелевой фазе не может упаковываться так, как фосфатидилэтаноламин. В этом случае ацильные цепи дипальмитоилфосфатидилхолина отклоняются на 30° от нормали к бислою, благодаря чему их поперечное сечение увеличивается и достигается соответствие размеру полярной головки. При этом углеводородные цепи сохраняют полнос-тью-транс-конфигурацию. В жидкокристаллической фазе появление в цепи гош-конформеров увеличивает эффективное поперечное сече-
ние цепей по меньшей мере до 50 А2в расчете на молекулу диациль-ного фосфолипида, а в водных дисперсиях эффективная площадь, приходящаяся на молекулу фосфолипида, составляет обычно 60 — 70 А2. Следовательно, в жидкокристаллической фазе углеводородные цепи не наклонены к плоскости бислоя, поскольку в этих условиях.полярные головки липидных молекул достаточно удалены друг от друга, и чтобы заполнить пространство между соседними головками и перекинуть между ними мостики, требуются вода и другие полярные молекулы. Судя по данным 2Н-ЯМР, толщина углеводородной области дипальмитоилфосфатидилхолинового бислоя в жидкокристаллическом состоянии составляет 35, а не 45 А, как следовало ожидать, если бы цепи находились в полностью-/я/*7«с-конфиругации и были ориентированы вдоль нормали к би-слою. Толщина бислоя уменьшается за счет наличия к цепях гош-конформеров, приводящих к разупорядоченности цепей, причем сами цепи в целом растянуты и расположены перпендикулярно поверхности бислоя, а не скручены в спираль. На рис. 2.12 приведена линейная зависимость толщины жидкокристаллического бислоя в диацилфосфатидилхолиновых везикулах от длины ацильных цепей, построенная по данным рассеяния рентгеновских лучей.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ГИДРОФОБНОЙ ОБЛАСТИ БИСЛОЯ
Для получения детальной картины строения внутренней области бислоя особенно полезными оказались два метода: Н-ЯМР и ИК-и КР-спектроскопия. Применение *Н- 13С-ЯМР для исследования мембран и водно-липидных систем затруднено, поскольку для получения пригодных для исследования малых везикул или мембранных фрагментов необходима предварительная фрагментация мембранного препарата с помощью ультразвука. Впрочем, если вращать образец под магическим углом, то необходимость в такой обработке отпадает, и это открывает новые возможности для более широкого применения последних методологических достижений ЯМР при изучении модельных и биологических мембран.
Применение методов 2Н-ЯМР и колебательной спектроскопии не сопровождается возмущениями бислоя, поскольку в этих методах не используются зонды, которые могли бы исказить структуру окружающих их липидов. Ниже приведены краткое описание этих методов и сводка результатов, полученных при изучении конфигурации ацильных цепей.
Спектроскопия комбинационного рассеяния
Лазерная спектроскопия комбинационного рассеяния оказалась весьма полезной для изучения физического состояния модельных и биологических мембран. Этот метод основан на измерении разности энергии падающего света и света, рассеянного за счет колебательных движений. Тип колебаний и их интенсивность очень сильно зависят от физического состояния липидов, поэтому спектры фосфолипидов в фазе геля и жидкокристаллическом состоянии существенно различаются. Особенно полезны для регистрации этих различий валентные колебания связи С—С. Например, появление гош-конформеров при плавлении углеводородных цепей приводит к увеличению интенсивности полосы при 1080 см-1. Этот метод показывает, что некоторая доля гош-конформеров сохраняется и в состоянии геля до тех пор, пока температура не снизится до очень низких значений, около - 200° С. Заметим, что колебания часто охватывают всю молекулу, так что количественная интерпретация спектров с точки зрения анализа влияния отдельных коиформаций является непростой задачей.
Обычно образцы представляют собой суспензию липидов в концентрации около 1 мг/мл. Мембраны, содержащие хромофоры или флуоресцирующие примеси, непригодны для изучения. Фоновая флуоресценция делает невозможным измерение относительно слабых сигналов комбинационного рассеяния, а поглощение хромофорами лазерного излучения приводит к нагреванию
Инфракрасная спектроскопия
Этот метод также основан на регистрации колебательных спектров молекул, но до недавнего времени его применение для изучения биологических объектов было ограниченным из-за невозможности работы с водными суспензиями. После разработки современных ИК-спектрометров с фурье-преобразованием многие из этих проблем были решены. В настоящее время опубликовано немало работ по изучению липидных дисперсий и биологических мембран методом фурье-ИК-спектроскопии. Преимущества этого метода перед спектроскопией КР состоят в его значительно более высокой чувствительности, а также в том, что флуоресцирующие примеси или хромофоры не мешают измерениям. Как и в случае спектроскопии КР, фурье-ИК-спектры чувствительны к изменениям полиморф-ио-фазового состояния липидов. Поэтому фурье-ИК-спектроскопия использовалась для изучения предпереходов в фосфатидилхолино-вых бислоях, главного фазового перехода гель—жидкий кристалл, а также перехода яичного фосфатидилэтаноламина из ламеллярной фазы в гексагональную Нц-фазу.
Изменение коиформации липидных цепей сопровождается частотным сдвигом полос поглощения групп СНг, причем эти изменения коррелируют с изменением доли гош-коиформеров в цепях. Например, в присутствии холестерола число гош-коиформеров в ди-пальмитоилфосфатидилхолине при температурах выше температуры главного фазового перехода снижается, что согласуется с изменениями упорядоченности бислоя, измеренной методом 2Н-ЯМР. Встраивание в бислой интегрального мембранного белка оказывает совершенно иной эффект: число гош-кон-формеров в жидкокристаллической фазе практически не изменяется, но увеличивается их содержание в фазе геля, поскольку белки мешают ацильным цепям упаковываться в полностью-транс-конфигура-ции.
Более детальную картину строения гидрофобной области липидного бислоя удалось получить с помощью метода 2Н-ЯМР. Атомы водорода в определенных местах липидной молекулы можно избирательно заменить дейтерием. Это сравнительно мяг-
кий способ зондирования мембран, и считается, что он, как правило, не вносит возмущений в их структуру. Спектры некоторых дейтерированных димиристоилфосфатидилхолинов представлены на рис. Расстояние между двумя пиками Avq, называемое квадрупольным расщеплением, зависит от усредненной по времени ориентации вектора С—D-связи по отношению к нормали к бислою. Усредненную по времени ориентацию можно выразить через параметр упорядоченности следующим образом:
где <cos20) отражает усреднение ориентации по времени, aScdявляется параметром упорядоченности связи. Необходимо подчеркнуть, что результат измерения является величиной, усредненной по всем молекулам.
При хаотичной ориентации. Этот параметр описывает усредненную ориентацию данного сегмента ацильной цепи: