Если проект увенчается успехом, то в недалеком будущем на нашей планете, возможно, вновь появится императорский дятел. В Государственном Дарвиновском музее уверены, что последние методы молекулярной биологии позволяют выделить и воспроизвести ДНК этих птиц. [9]
Дронт
В июне 2006 года голландские учёные обнаружили на острове Маврикий хорошо сохранившиеся останки дронта - вымершей исторически недавно (в XVII веке) нелетающей птицы. Ранее наука не располагала останками птицы, в исчезновении которой, как всегда, виноват человек. Но теперь появилась определенная надежда на "воскресение" удивительного представителя пернатых. [10]
Клонирование гигантских птиц
Планы по клонированию исчезнувших гигантских птиц были поставлены под сомнение в результате исследований учёных Оксфордского университета. Выделив участки ДНК из останков вымерших птиц, ученые обнаружили, что их генетический материал настолько разрушен, что современная технология не позволяет провести полноценное клонирование. Цель научных работ состояла в возрождении вымерших несколько веков назад новозеландского страуса Моа, а также Мадагаскарского эпиорниса (птицы-слона).
Образцы ДНК были взяты из фрагментов тканей, сохранившихся в музеях. Однако ученые не смогли получить достаточную по своей длине цепочку ДНК, чтобы провести клонирование. Тем не менее, некоторые ученые считают, что в ближайшие годы будет разработана технология восстановления утраченных частей ДНК, путем вшивания туда "заплат" из ДНК близкородственных видов.
1970 - успешное клонирование лягушки[12]
1985 - клонирование костных рыб[13]
1996 — овечка Долли.
1997 — первая мышь.[14].
1998 — первая корова[15].
1999 — первый козёл[16].
2001 — первая кошка[17].
2002 — первый кролик[18].
2003 — первые бык[19], мул[20], олень[21].
2004 — первый опыт клонирования с коммерческими целями (кошки).[22]
2005 — первая собака (афганская борзая по кличке Снуппи).[23]
2006 — первый хорёк
2007 - вторая собака [24]
2008 — третья собака (лабрадор по кличке Чейс). Клонирована по государственному заказу[25]. Начало коммерческого клонирования собак[26]
3. Методы клонированияживотных
Последние десятилетия XX века ознаменовались бурным развитием одной из главных ветвей биологической науки -- молекулярной генетики. Уже в начале 70-х годов ученые в лабораторных условиях начали получать и клонировать рекомбинантные молекулы ДНК, культивировать в пробирках клетки и ткани растений и животных. Возникло новое направление генетики генетическая инженерия. На основе ее методологии начали разрабатываться различного рода биотехнологии, создаваться генетически измененные организмы (ГМО). Появилась возможность генной терапии некоторых заболеваний человека, а последнее десятилетие XX века ознаменовалось еще одним важным событием -- достигнут огромный прогресс в клонировании животных из соматических клеток.
Особенно большой резонанс у мировой общественности получили исследования шотландских ученых из Рослинского Университета, которым удалось из клетки молочной железы беременной овцы получить генетически точную ее копию. Клонированная овца по кличке Долли нормально развивалась и произвела на свет сначала одного, а затем еще трех нормальных ягнят. Вслед за этим появился ряд новых сообщений о воспроизведении генетических близнецов коров, мышей, коз, свиней из соматических клеток этих животных. У приматов, в частности, у обезьян пока не удалось получить клоны с использованием клеток взрослого организма, плода или даже эмбриональных стволовых клеток.
Тем не менее работы в этом направлении активно ведутся. В прошлом году появилось сообщение о клональном размножении потомства приматов путем деления зародыша. Американским исследователям удалось получить генетически идентичные эмбрионы обезьяны резус путем разделения бластомеров зародыша на стадии деления. Из эмбриона родилась вполне нормальная обезьянка Тетра.
Такой тип клонирования обеспечивает генетически идентичное потомство, и в результате можно получить двойню, тройню и более генетических близнецов. Это позволяет проводить теоретические исследования по эффективности новых методов терапии тех или иных заболеваний, появляется возможность повторять научные эксперименты на абсолютно генетически идентичном материале. Имплантируя зародыши последовательно одной и той же суррогатной самке, можно исследовать влияние ее организма на развитие плода [31].
Разработанные методы клонирования животных пока еще далеко не совершенны. В процессе экспериментов наблюдается высокая смертность плодов и новорожденных. Еще не ясны многие теоретические вопросы клонирования животных из отдельной соматической клетки.
Тем не менее успех, достигнутый в клонировании овцы и обезьян, показал теоретическую возможность создания генетических копий также человека из отдельной клетки, взятой из какого-либо его органа. Многие ученые с энтузиазмом восприняли идею клонирования человека.
3.1 Методы трансплантации ядер
В нашей стране Б.В. Конюховым и Е.С. Платоновым в 1985 г. был разработан метод менее травматического переноса ядер методом микроманипуляции. Он протекает в два этапа: сначала тонкой микропипеткой прокалывают зоны пеллюцида и плазматической мембраны и извлекают пронуклеусы, а затем другой пипеткой, большего диаметра (12 мкм) в то же отверстие вводят диплоидное ядро донора. В этом случае меньше травмируется цитоплазма зиготы и транспортируемое ядро донора.
Трансплантация ядер может осуществляться и другим способом, с использованием цитохалазинов (веществ, синтезируемых грибами).
Цитохалазин В разрушает структуру микрофиламентов и способствует уникальному расположению ядра. Ядро остается соединенным с клеткой тоненьким стебельком цитоплазмы. При центрифугировании этот мостик разрывается, образуются безъядерные клетки (цитопласты) и кариопласты, представляющие собой ядра, окруженные тонким слоем цитоплазмы и цитоплазматической мембраной. Цитопласты отделяют от интактных клеток в градиенте плотности. Они сохраняют способность прикрепляться к поверхности культурального сосуда и могут быть использованы для слияния с кариопластами других клеток с целью получения жизнеспособной клетки [14][12].
Методы выделения кариопластов несколько сложнее и включают в себя ряд операции по центрифугированию, разделению в градиенте плотности и т.д. В некоторых случаях к смеси клеток и кариопластов добавляют частицы тантала диаметром 1 – 3 мкм. Они проникают в клетки и никогда в кариопласт, поэтому более тяжелые клетки осаждаются быстрее кариопластов.
Цитопласты содержат все виды органелл, присущие нормальной клетке, сохраняют способность прикрепляться к субстрату, образовывать складчатую мембрану, передвигаться, осуществлять пиноцитоз.
Кариопласты окружены тонким слоем цитоплазмы (около 10% от всей клеточной цитоплазмы), содержат компактный эндоплазматический ретикулум, несколько митохондрий и рибосом. У некоторых клеточных линий 1/10 кариопластов способна восстановить весь утраченный объем цитоплазмы и восстановиться в жизнеспособные клетки.
Для реконструкции клеток суспензию кариопластов в солевом буфере добавляют к монослою культуры цитопластов из пропорции 100 кариопластов на 1 цитопласт. Цитопласты должны быть уже покрыты инактивированными вирусными частицами. Инкубируют при температуре 4оС 45 минут, а затем еще 45 минут при температуре 37оС. Отмывают раствором Эрла для удаления не слившихся кариопластов [8].
3.2 SLIC (sequenceandligation-independentcloning) метод клонирования
Стив Элледж и неутомимая Мами Ли в очередной раз порадовали научное сообщество оригинальным методом клонирования. Новыйметодполучилназвание SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка является модификацией известного метода LIC (ligation-independent cloning) - клонирования без использования лигазы. Для того чтобы вставить фрагмент ДНК в вектор при помощи классического метода LIC, достаточно смешать вектор и вставку, на концах которых расположены протяженные одноцепочечные участки, комплементарные друг другу. При этом вставка "прилипает" к вектору, образуя рекомбинантную плазмиду с никами в обеих цепях. Полученной плазмидой трансформируют Е.coli, система репарации которой восстанавливает нормальную структуру плазмиды.
Метод SLIC - это то же самое, что и LIC с единственной разницей: "слипание" вектора и вставки проводят в присутствии белка RecA. Эта незначительная модификация метода позволяет добиться достаточно высокого выхода (1 нг. вектора способен дать 3900 трансформантов) а также упростить саму процедуру клонирования. Так если для классического метода LIC необходимо точно подогнать размер одноцепочечных участков у вектора и вставки (чтобы в итоге на стыке вектора и вставки получились ники), то метод SLIC допускает наличие протяженных гэпов [19].
Фактор RecA- один из ключевых факторов репарации и рекомбинации E.coli. Связываясь с одноцепочечным участком ДНК, RecA стимулирует процесс "strand exchange" (в ходе этого процесса одноцепочечный участок одной молекулы ДНК встраивается в гомологичный двухчепоченый участок другой молекулы ДНК, образуя D-петлю). Очевидно, добавление RecA in vitro на шаге клонирования позволяет E.coli эффективнее репарировать плазмиду in vivo.
Для успешного клонирования необходимо наличие 30-ти нуклеотидных участков гомологии по краям вектора и вставки. Получать одноцепочечные участки предлагается с помощью T4 ДНК-полимеразы без добавления нуклеотидов. При помощи SLIC в один вектор можно запихнуть сразу 5 вставок в одну стадию без снижения выхода. Наконец, высокий выход позволяет использовать метод SLIC при клонировании библиотек [7].
3.3 Метод генетического перепрограмирования клеток кожи
Разработан новый метод клонирования – менее трудоемкий, чем способ, благодаря которому была создана овечка Долли. В связи с этим возникли опасения, что однажды он будет использован для обработки эмбрионов человека, дабы формировать детей "по заказу".