ГОУ ВПО
(КЕМЕРОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ)
Биологический факультет
Кафедра генетики
генетике и иммунохимии
Тема: Иммунологические методы, основанные
на взаимодействии антиген – антитело
д.м.н. А.В. Шабалдин
Работу выполнила
ст. 5 курса
биологического факультета
Лунина А.А.
1. Двойная радиальная иммунодиффузия по Ухтерлони
Принцип
Проведение иммунодиффузии
Оценка результатов
Определение титра
Область применения
2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену
Принцип
Проведение иммунодиффузии
3. Простая радиальная иммунодиффузия по Манчини
Принцип
Проведение исследования
Оценка метода
4. Нефелометрия
Принцип метода
Проведение исследования
Оценка метода
5. Иммунодот и иммуноспот
6. Список литературы
В современное время широко используют методы, основанные на взаимодействии антиген – антитело. К данным методам относятся методы иммунодиффузии, нефелометрии, иммунодот и иммуноспот. Они широко используются для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными. Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных.
В слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации.
Расплавляют агар (1,5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0,15 М раствор NaCl, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально.
Чтобы усилить сцепление геля с поверхностью стекла, предметные стекла рекомендуется покрыть агаровой пленкой. Для этого на стекло наносят 1%-ный водный агаровый золь и высушивают при 70°С.
В зависимости от задачи иммунохимического анализа для вырезания лунок в геля применяют либо специальные штампы разного профиля, либо инъекционные иглы, металлические или стеклянные трубочки с разными краями. Лунки для антигенов и антисыворотки располагают на расстоянии не менее 4 и не более 10 мм.
Заполнив лунки соответствующими растворами, пластинки помещают во влажную камеру. Иммунодиффузию можно проводить при 4, 20 и 37°С. Она длится не менее 24ч и может продолжаться до 6-7 дней. Образование новых линий преципитации следует наблюдать ежедневно. Продолжительность иммунодиффузии зависит от конкретной задачи исследования и от ряда других факторов. Результаты иммунодиффузии учитывают непосредственно на влажном препарате или сначала удаляют непреципитировавшие белки. Для этого препараты 2-3 раза погружают на 12 ч в ванночку с 0,15 М раствором NaCl, затем поверхность геля накрывают фильтровальной бумагой, смоченной в дистиллированной воде, и высушивают при комнатной температуре. Высушенные препараты окрашивают, например амидо-черным 10В, и учитывают результаты иммунодиффузии.
Число линий преципитации
У разных антигенов часто бывают сходные коэффициенты диффузии. Поэтому в многокомпонентных системах антиген-антитело в одном и том же участке геля могут появиться преципитаты разной специфичности, образующие одну линию преципитации. В других случаях концентрации антигенов и антител и их соотношения могут оказаться настолько неблагоприятными, что заметной преципитации просто не произойдет. Поэтому число видимых линий преципитации обычно меньше числа систем антиген-антитело и лишь в лучшем случае равно ему.
Расположение преципитатов между лунками
При оптимальном соотношении между антигеном и антителом линия преципитации располагается почти посередине между лунками. Количественное преобладание одного из реагентов сдвигает линию преципитации к лунки другого реагента. Относительная концентрация реагентов в месте первоначальной преципитации может изменится, например из-за дополнительного поступления одного из них; тогда происходит сдвиг фронта преципитации, но часть иммунных агрегатов, особенно на стороне избытка антител остается в прежнем положении, и их можно обнаружить в виде вуали или отдельной зоны преципитации. Возможность подобных явлений заставляет при длительной иммунодиффузии ежедневно просматривать препараты.
Взаимное расположение линий преципитации: сравнительный анализ
Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку.
Если линии полностью сливаются, то антигены полностью идентичны. Если линии пересекаются, то антигены не идентичны. Если одна из линий длиннее другой, и выходя из нее образует шпору, то антигены частично идентичны. Оба антигена имеют некоторые общие детерминанты, но у одного антигена имеются детерминанты, которых нет у второго, именно они образуют шпору. Если две линии преципитации пересекаются, частично сливаясь, антигены имеют как одинаковые, так и различные детерминанты.
Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают:
1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок;
2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат;
3. интенсивность и ширину полос преципитации.
Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.
Качественный анализ, например для определения числа антигенов в различных жидкостях (сыворотке крови, цереброспинальной жидкости), для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными.
Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3-7%.
2. Простая линейная иммунодиффузия по Удену
Гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, и в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Число линий преципитации зависит от числа реагирующих систем антиген-антитело. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.
Моноспецифические антисыворотки, стандартные растворы антигенов и рабочий стандарт, веронал-ацетатный буфер с pH 8,6 и ионной силой 0,1. Специальный агар Noble; стеклянные капилляры для определения гематокрита длиной около 50 мм, с внутренним диаметром 1-1,5 мм; измерительная лупа с точностью до 0,1 мм.
В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген.
В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления. Агар охлаждают до 48°С и смешивают с равным объемом подогретой до 48°С антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, с тем чтобы она заполнила их на 2-3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к употреблению.
Капилляры погружают в растворы антигенов, но перед погружением капилляров в антиген следует довести температуру всех реагентов до нужной величины, например до 4°С. Реакция длится 48 ч. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.
Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h, на квадратный корень из времени диффузии t.
При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.
Оценка метода
Критическим фактором является температура. Продолжительность инкубации зависит от величины диффундирующих молекул, чаще всего длится 12, 24 или 48 часов.