Например, при изучении процессов раннего развития Xenopus важно знать, какие гены экспрессируются при первых клеточных делениях. Для этого нужно идентифицировать те мРНК, которые присутствуют в гаструле, но не в яйцеклетках. Это можно сделать, создав геномную библиотеку и проведя раздельный скрининг с использованием препаратов РНК из яйцеклеток и гаструл. Затем можно идентифицировать и клонировать фаговые бляшки, которые дают положительный ответ при отжиге только с РНК гаструл. Однако данный метод имеет тот недостаток, что многие из 105 или более мРНК в двух указанных выше препаратах являются одинаковыми и приходится проводить скрининг громадного числа бляшек, чтобы обнаружить те немногие, которые проявляют специфичность. Более эффективным является создание библиотеки кДНК на основе гаструлярной РНК.
Клонирование кДНК, кодирующей малую субъединицу рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы из листьев гороха.ruBPCase, - по-видимому, один из самых распространенных на земле белков, - состоит из восьми идентичных больших и восьми идентичных малых субъединиц. Ген большой субъединицы находится в хлоропластной ДНК, а ген малого полипептида - в ядерной хромосомной ДНК. Экспрессия генов зависит от освещенности, о чем свидетельствуют данные, представленные в левой верхней части рисунка. Растения гороха выдерживали 9 сут. в темноте и затем некоторые из них выставляли на свет на 48 ч. Полисомную poly-РНК, выделенную из растений обоих типов, транслировали in vitro.20 кДа - предшественник малой субъединицы RuBPCase синтезировался только в тех растениях, которые находились на свету. РНК из листьев растений, подвергшихся освещению, использовали для синтеза двухцепочечной кДНК, к которой были присоединены Hind III-линкеры. ДНК лигировали с разрезанной в Hind Ill-сайте плазмидой pBR322 и полученными рекомбинантными плазмидами трансформировали штамм НВ101 Е. coli. Трансформированные бактериальные колонии, устойчивые к ампициллину, выращивали на нитроцеллюлозных фильтрах, помещенных на поверхность питательного агара в чашках. После фиксации ДНК на фильтрах клоны, содержащие кДНК RuBPCase, идентифицировали по их способности гибридизоваться с радиоактивно меченной poly-РНК из подвергавшихся освещению листьев и по отсутствию гибридизации с РНК из листьев растений, выращенных в темноте. Ложные положительные клоны элиминировали, проводя гибридизацию исходно положительных клонов с радиоактивно меченной РНК, обогащенной по мРНК RuBPCase. Обогащение проводили фракционированием РНК по размерам с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Искомая мРНК представляла собой молекулу длиной 900 п. н., присутствующую в подвергшихся освещению листьях, при трансляции которой in vitro образовывалась малая субъединица RuBPCase. Наконец, гибридные клоны были идентифицированы также при гибридизационной селекции. рая была предварительно обогащена последовательностями мРНК, специфичными для стадии гаструлы. Такое обогащение можно получить следующим образом. С помощью обратной транскриптазы на мРНК из гаструл синтезируют одноцепочечную кДНК. Затем все кДНК, гомологичные мРНК, присутствующим как в яйцеклетках, так и в гаструлах, удаляют путем образования гибридов кДНК'мРНК между кДНК гаструл и мРНК яйцеклеток; эти гибриды адсорбируются на гидроксиапатите, а в растворе остаются только одноцепочечные кДНК, специфичные для гаструл. Из этих кДНК получают обычным способом дуплексные молекулы кДНК и создают библиотеку кДНК. Такая библиотека обычно бывает сильно обогащена молекулами кДНК, соответствующими гаструлоспецифичной мРНК. Аналогичный подход можно использовать в случае мРНК, выделенной из любых двух родственных тканей или клеток. Вариации на эту тему включают использование в качестве зондов молекул кДНК, обогащенных описанным выше методом. В этом случае водили котрансфекцию с участием ДНК из этих клеток, отбор в среде HAT, сортировку и клонирование. ДНК из полученных вторичных трансформантов, содержащую менее 50 т.п. н. ДНК человека на мышиный геном, использовали для создания геномной библиотеки. Было отобрано шесть фаговых клонов, которые гибридизовались с зондом, содержащим повторяющиеся последовательности ДНК человека, разбросанные по всему геному. Все шесть клонов содержали перекрывающиеся сегменты ДНК. Две вставки из шести встраивали в фаговые векторы для воссоздания уникального сегмента ДНК размером 31 т.п. н., ответственного за синтез поверхностного рецептора трансферрина человека, после трансфекции в мышиные клетки.
Библиотеку кДНК подвергают скринингу, выявляя те клоны, которые гибридизуются с обогащенным мРНК - зондом.
Мы рассмотрели множество разных методов, используемых при конструировании, клонировании и отборе специфических рекомбинантных генов. На основе этих методов можно разработать множество стратегий для получения определенных клонированных генов или кДНК. При выборе эффективной и действенной стратегии важно учитывать природу гена и его продукта, а также происхождение вида. Чтобы представить себе все многообразие методов работы с рекомбинантными молекулами ДНК, лучше всего рассмотреть конкретные примеры клонирования различных генов и кДНК.