Исследование роста микромицетов на различных источниках углеродного питания (стр. 5 из 6)
сернокислый цинк – 0,07;
сернокислое железо – 0,07;
кремнекислый калий – 0,07;
дистиллированная вода – 1,5 л.
Более простой состав имеет среда Чапека (г/л):
сахароза – 30,0;
NaNO3 – 2,0;
MgSO4 – 0,5;
FeSO4 – 0,01;
KH2PO4 – 1,0;
KCl – 0,5;
дистиллированная вода – 1,0 л.
Для многих грибов указанные здесь среды являются неполноценными. Некоторые грибы (особенно витаминозависимые) растут на них плохо или совсем не растут. В таких случаях, если потребность данного организма в витаминах не изучена, необходимо добавлять в среду экстракты растительных или животных тканей, выбирая их исходя из экологии данного гриба. Например, в среды для выращивания грибов – дереворазрушителей добавляют опилки из древесины той породы дерева, которую они поражают в природе, для выращивания грибов – паразитов растений – ткани растения – хозяина; выращивание грибов – копрофилов производится на средах с навозным экстрактом (Беккер, 1983).
2.6 Приготовление питательных сред
Посуда для приготовления сред не должна содержать посторонних веществ, например щелочей, выделяемых некоторыми сортами стекла. Перед употреблением посуду тщательно мыли, полоскали и высушивали. Среды варили в стеклянных колбах объемом 250 мл. Каждой среды готовили объемом по 100 мл, рассчитанной на 5 культур исследуемых штаммов. После варки среды стерилизовали в автоклаве при 0,5 атм и 120 ○С в течение 20 минут. После стерилизации и добавления соответствующих источников углеродного питания среды разливали в стерильные чашки Петри по 20 мл. Предварительно в чашки вносят по 1 капле молочной кислоты для подкисления среды, которое необходимо, чтобы убить бактерии.
2.7 Определение способности плесневых грибов использовать соединения углерода
Микромицеты характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического метаболизма. Чтобы выяснить возможность роста гриба за счет тех или иных углеродсодержащих веществ, их высевают на синтетические среды, содержащие в качестве единственного источника углерода различные моно-, ди- и полисахариды, многоатомные спирты, органические кислоты, углеводороды.
В качестве единственного источника углерода были выбраны природные растительные материалы: растительный опад, камыш, опилки, кора, сено. Источники углерода добавляли в среду в мелко нарезанном виде. Все источники углерода добавлялись в среды количеством 30 г./л.
В данной работе определение особенностей роста грибов на различных источниках углеродного питания проводилось путем поверхностного посева исследуемых штаммов на среду Чапека с различными источниками углерода. Посев культур осуществляли уколом в центр чашки Петри. Время культивирования составляло 14 суток, температура культивирования – 25 ○С. Значение применяемых питательных сред для процессов роста грибов оценивалось методом измерения радиальной скорости роста путем периодического замера диаметра колоний грибов (через каждые 48 часов), растущих на чашках Петри.
Для определения способности микромицетов использовать различные источники углерода применяют и другие методики.
Например, многие микромицеты могут использовать в качестве единственного источника углерода органические кислоты. Для определения способности расти на средах с органическими кислотами рекомендуется плотная среда состава (г/л): (NH4)2HPO4 – 0,5; MgSO4*7H2O – 0,2; NaCl – 0,1; агар – 15,0; органическая кислота в виде соли Na или К – 2,0; pH 6,8. До стерилизации к среде добавляют 20 мл 0,04% водного раствора индикатора метилрот, который в интервале pH 6,8 – 8,4 изменяет окраску от желтой к красной. Среду разливают в пробирки и стерилизуют при 1 атм. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования от 2 до 14 суток в зависимости от скорости роста микроорганизмов. О потреблении органических кислот свидетельствует рост по уколу и изменение кислотности среды в щелочную сторону, что отчетливо заметно по цвету индикатора.
Некоторые грибы способны использовать и такие химически устойчивые соединения, как углеводороды. Выявить способность микроорганизма окислять жидкие нелетучие углеводороды можно на плотной среде состава (г/л): KNO3 – 4,0; KH2PO4 – 0,6; Na2HPO4*12H2O – 1,4; MgSO4*7H2O – 0,8; выщелоченный агар – 2,0; pH 7,2. Среду стерилизуют в колбах при 1 атм. и разливают в чашки Петри толстым слоем. После того как среда застынет, в центре агаровой пластинки вырезают лунку. Для этой цели можно воспользоваться пробочным сверлом (диаметр 8–10 мм), которое предварительно стерилизуют в пламени горелки. Микромицеты высевают радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. В лунку вносят 2–3 капли исследуемого углеводорода (стерилизуют фильтрованием). Чашки помещают в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 7–10 суток отмечают наличие или отсутствие роста по штриху в сравнении с контролем – ростом на среде без углеводорода (Нетрусов, 2005).
2.8 Определение радиальной скорости роста
Определение радиальной скорости роста грибов проводили на плотной питательной среде за определенный промежуток времени. После 48 часов инкубации при 25 ○С измеряют диаметр выросших на чашках колоний при помощи линейки. Эту операцию повторяют через каждые двое суток в течение двух недель.
За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают среднее арифметическое измерение. Вычисление радиальной скорости проводят по формуле:
Kr= (r – ro) / (t – to),
где k – радиальная скорость роста;
ro – радиус колоний в начальной момент времени to;
r – радиус колоний в момент времени t (Паников, 1991).
2.9 Обработка полученных данных
В процессе культивирования измеряли диаметр колоний каждые 48 ч и определяли радиальную скорость роста, амплитуду ее изменчивости, характер биоритмов.
На основании полученных данных составляли графики зависимости радиальной скорости роста исследуемых штаммов от времени, определяли способность исследуемых штаммов использовать в качестве единственного источника углерода природные растительные материалы (камыш, сено, растительный опад, опилки, кора).
3. Исследование роста микромицетов на различных источниках углеродного питания
Объектами исследования явились коллекционные штаммы микроскоскопических родов Aspergillusflavus, A. fumigatus, Alternariasp., Penicilliumsp., Cladosporiumsp., Trichodermasp., Verticilliumsp. В качестве источника углерода использовали природные растительные материалы: камыш, кору, растительный опад, опилки, сено.
В результате посева исследуемых микроскопических грибов на среду Чапека с различными источниками углерода было установлено, что изменение трофических условий оказывает существенное влияние на развитие микромицетов. Оценка возможности потребления различных источников углерода показала, что они способны утилизировать многие источники углеродного питания, но большинство из исследуемых видов не использовали опилки в качестве единственного источника углерода. Динамика роста видов на разных средах при одинаковых условиях инкубации, не одинакова.
В таблице приложения и на рисунках 1–7 приведены зависимости радиальной скорости роста от времени у изученных грибов на различных источниках углерода.
A. fumigatus развивается на всех источниках углерода с высокой скоростью роста, за исключением среды с опилками, на которой совсем не проявляет признаков роста. До 96 ч. экспозиции радиальная скорость роста на всех средах была примерно одинакова, затем на среде с листьями наблюдается скачок роста (в 4 раза по сравнению с другими средами) в интервале 144 – 192 ч. На остальных средах A. fumigatus растет примерно с одинаковой скоростью, но различались ритмичностью биоритмов. На среде с камышом имеет четкие 2-суточные ритмы. Биоритмы большей продолжительности (4-суточные) отмечены на средах с корой и сеном. Однако на среде с корой A. fumigatusобладает несколько большей скоростью роста. К 288 ч. культивирования скорость радиального роста становятся примерно одинаковой на всех средах.
Рис. 1. Радиальная скорость роста A. fumigatus, мм/ч
Рис. 2. Радиальная скорость роста A. flavus, мм/ч
Радиальная скорость роста A. flavus на протяжении всей экспозиции значительно не изменялась. Максимальная скорость роста на среде с сеном приходится на 96 ч., на средах с листьями, камышом и корой – на 192 ч. времени культивирования. Также как и A. fumigatus, A. flavusне использует опилки в качестве единственного источника углерода. На средах с листьями и сеном вид растет с 2-суточной периодичностью. Биоритмы большей продолжительности (3,5–4-х суток) наблюдаются на средах с камышом и корой.
Рис. 3. Радиальная скорость роста Alternariasp., мм/ч
По данным графика видно, что Alternaria на среде, где в качестве единственного источника углерода присутствует кора, проявляет наибольшую скорость роста с биоритмами 2-ое суток. На среде с сеном Alternaria развивается с очень низкой скоростью и уже к 192 ч. экспозиции прекращает рост. На средах с листьями и камышом растет с одинаковой радиальной скоростью роста до 96 ч. культивирования, затем на среде с камышом происходит скачок примерно в 1,5 раза. На этих средах Alternaria проявляет замедленную ритмичность (более 2-х суток).
Рис. 4. Радиальная скорость роста Cladosporium sp., мм/ч
Исходя из данных графика 4 видно, что Cladosporiumрастет на среде с корой с наибольшей скоростью роста и с периодичностью 2-ое суток. К 10-ти суткам культивирования рост на этой среде прекращается. На среде с листьями микромицет растет с меньшей ритмичностью (более 2-суточные биоритмы). С наименьшей радиальной скоростью роста Cladosporium развивается на средах с камышом и сеном с биоритмами четверо суток и прекращает расти к 192 ч. экспозиции. На всех средах рост прекращается еще до 14 дней культивирования.