Маслянокислые бактерии являются также возбудителями ацетонобутилового брожения, анаэробного брожения клетчатки и брожения пектиновых веществ.
Ацетонобутиловое брожение представляет собой превращения углеводов бактериями с образованием ацетона и бутилового спирта. При этом брожении, кроме ацетона и бутилового спирта, вырабатываются также масляная и уксусная кислоты, водород и углекислый газ. Суммарно данное брожение можно выразить следующим уравнением:
12 С6Н12О6 → СН3СН2СН2СН2ОН + 4СН3СОСН3 + СН3СН2ОН + СН3СН2СН2СООН + 18Н2 + 28СО2 + 2Н2О + Х кДж
Механизм ацетонобутилового брожения
Химизм ацетонобутилового брожения еще недостаточно выяснен. В последнее время для изучения его используют метод меченых атомов. В бродящую среду вводят промежуточные продукты брожения (уксусную, ацетоуксусную и масляную кислоты), содержащие углерод С13, а затем определяют наличие этого углерода в конечных продуктах. Этим способом установлено, что при добавлении уксусной кислоты с С13 около 50% всего меченого углерода содержится в бутиловом спирте, около 15%- в ацетоне, до 18% - углекислом газе. При добавлении масляной кислоты, содержащей С13, около 85% меченого углерода переходит в бутиловый спирт. Он найден также в этиловом спирте, в уксусной и масляной кислотах. Исходя из этих данных, считают, что образование бутилового спирта идет главным образом через масляную кислоту. Кроме того, полагают, что ацетон образуется через масляную кислоту.
В химизме ацетонобутилового брожения имеется много общего с маслянокислым, а частности, первые стадии до образования ацетольдоля протекают подобно маслянокислому брожению. Далее между двумя молекулами ацетальдоля протекает окислительно – восстановительная: оксимасляная кислота и оксибутиловый спирт по следующему уравнению: реакция, в результате которой образуются два соединения: β - оксимасляная кислота и β - оксибутиловый спирт по следующему уравнению:
2СН3СНОСН2СНО + Н2О → СН3СНОНСН2СООН + СН3СНОНСН2СН2ОН
β - Оксимасляная кислота далее отщепляет водород и переходит в ацетоуксусную кислоту, которая затем распадается на ацетон и углекислый газ:
СН3СНОНСН2СООН → СН3СОСН2СООН → СН3СОСН3 + СОв –
оксибутиловый спирт подвергается восстановлению до n- бутилового спирта согласно уравнению:
CН3СНОНСН2СН2ОН + Н2 → СН3СН2СН2СН2ОН + Н2О
Часть уксусного альдегида, по-видимому, также вовлекается в окислительно-восстановительную реакцию с образованием уксусной кислоты и этилового спирта:
СН3СНО + СН3СНО + Н2О →СН3СООН + СН3СН2ОН
В ацетонобутиловом брожении наблюдаются две фазы: первая - кислотная, во время которой усиленно размножаются бактерии, а в среде накапливаются масляная и уксусная кислоты, и вторая - ацетонобутиловая, в ней уменьшается кислотность и происходит усиленное накопление ацетона, бутилового и этилового спиртов. В зависимости от условий брожения, т. е. подавляя какую – либо фазу брожения, можно получить усиленное накопление тех или иных продуктов. Следовательно, ацетонобутиловое брожение отличается от маслянокислого: при маслянокислом брожении накапливающиеся кислоты постепенно замедляют процесс кислотообразования и даже останавливают его, а при ацетонобутиловом – образовавшиеся кислоты потребляются бактериями и превращаются в другие вещества.
Первый возбудитель ацетонобутилового брожения выделен в 1911 г. Бейеринком. Он получил название Granulobacter butyricum. Более активным возбудителем этого брожения явился вид Clostridium acetobutyricum. Клетки его по морфологическим признакам сходны с маслянокислыми бактериями. Это подвижные, грамположительные, палочки со спорами, развивающиеся в анаэробных условиях. Спорообразование - клостридиальное. В клетках накапливается гранулеза. По биохимическим свойствам данный вид сильно отличается от маслянокислых бактерий. Начиная с 1923 г. ацетонобутиловые бактерии используются в промышленных масштабах для получения ацетона и бутилового спирта из крахмалистого сырья и мелассы.
Среди возбудителей маслянокислого брожения встречаются такие культуры, которые способны вызывать брожение клетчатки. Способность анаэробных микроорганизмов разрушать клетчатку впервые была установлена в 1875г. Л. Поповым, а сущность этого процесса раскрыта в 1889- 1902 гг. В. Л. Омелянским, который выделил две разновидности целлюлозоразрушающих бактерий. Одна из них вызывает водородное брожение клетчатки Bac. cellulosae hydrogenicus ,а вторая – метановое Bac. cellulosaemetanicus. У этих бактерий морфологических различий почти не наблюдается. Молодые формы - необычайно тонкие, прямые, иногда слегка изогнутые палочки, толщиной от 0,3 до 0,5 мкм и длиной от 4 до 8 мкм. По мере развития палочки удлиняются и достигают 10-15 мкм, затем на их конце их образуются споры. При этом клетки приобретают форму барабанной палочки. Со временем спора в виде круглого тельца освобождается от клетки. Одним из существенных морфологических различий между водородными и метановыми бактериями является разная способность к спор к прорастанию. Споры возбудителя метанового брожения прорастают намного быстрее спор водородного брожения.
Химизм этого брожения сложен, так как целлюлозоразлагающие бактерии сначала переводят углеводы в растворимые сахара, которые затем частично сбраживают главным образом до масляной и уксусной кислот. Из других продуктов эти бактерии продуцируют спирт, муравьиную и молочную кислоты, а также выделяют газы - водород или метан (в зависимости от культуры) и углекислый газ.
При водородном брожении газообразные вещества - водород и углекислота - составляют примерно 1/3 массы разложившейся клетчатки. При метановом брожении газообразных веществ (метана, углекислоты) получается больше, они составляют примерно половину массы разложившейся клетчатки.
Возбудители водородного и метанового брожения наряду с клетчаткой способны сбраживать соли масляной, молочной, муравьиной и других кислот, накапливающиеся при брожении клетчатки. В результате такого процесса в анаэробных условиях достигается полная минерализация клетчатки - наиболее сложного и устойчивого полисахарида. В последнее время установлено, что возбудители маслянокислого брожения клетчатки являются активными продуцентами витамина В12. Это свойство их используется для промышленного получения кормового витамина В12.
Пектиновые вещества входят в состав тканей растений. Являясь составной частью клеточной оболочки, они как бы склеивают клетки между собой, образуя межклеточные пластинки. Они находятся в значительном количестве в некоторых органах растений, например, в листьях, в мякоти плодов, ягод, корнеплодов, в кожице цитрусовых и во многих других.
Пектиновые вещества в природе минерализуются микроорганизмами, обладающими ферментами протопектиназой (пектазой) и полигалактуроновой (пектиназой). Фермент протопектиназа расщепляет в пектине связи между метоксилированной полигалактуроновой кислотой и связанным с ней арабаном. Освободившаяся при этом метоксилированная полигалактуроновая кислота (растворимый пектин) под действием пектинэстеразы гидролизуется с образованием метилового спирта и полигалактуроновой кислоты.
Полигалактуроновая кислота подвергается также действию другого фермента - полигалактуроназы микроорганизмов (бактерий и плесневых грибов). Этот фермент гидролизует гликозидные связи между остатками галактуроновой кислоты, не содержащими метоксильных групп. Галактуроновые кислоты наряду с другими соединениями гидролизуются и используются микроорганизмами в качестве источника углерода. В результате гидролиза пектина образуются продукты: галактуроновая кислота, галактоза, арабиноза, ксилоза, уксусная кислота и метиловый спирт. Некоторые из них – моносахариды – используются этими же пектинразлагающими микроорганизмами, так арабиноза сбраживается ими до масляной кислоты и углекислоты, а из галактозы наряду с масляной и угольной кислотами выделяется водород (Емцев, Мишустин, 2006).
Среди пектинразлагающих микроорганизмов известны бактерии вида Clostridium pectinovorum, которые вызывают маслянокислое брожение пектиновых веществ (описаны Бейеринком в 1902 г.). Они представляют собой сравнительно крупные, подвижные, грамположительные палочки длиной 10-15 мкм и шириной 0,8 мкм. В клетках образуются споры, которые располагаются на утолщенных концах. Относятся эти бактерии к облигатным анаэробам. При сбраживании пектиновых веществ они накапливают масляную и уксусную кислоты, водород и углекислый газ. При соответствующих условиях брожения могут вырабатывать, кроме основных продуктов брожения, бутиловый спирт и ацетон.
Возбудителем пектинового брожения является также Clostridium felsineum. Микроорганизм выделен итальянским исследователем Карбонэ в 1916 г. из стеблей конопли. По форме клеток – споровая палочка одиночная или соединенная в короткие цепочки размерами 3/ 5 * 0,3 мкм. Споры располагаются на конце (барабанная палочка), но иногда бывают и в центре клетки. Культура обладает сравнительно высоким температурным оптимумом. Она сбраживает пектиновые вещества с образованием преимущественно уксусной кислоты и совершенно не продуцирует масляной.