Через 3-4 суток при 60оС в пробирках начинается процесс разрушения клетчатки, жидкость пенится, выделяется газ. Полоски фильтровальной бумаги желтеют, ослизняются, постепенно превращаясь в аморфную массу и оседают на дно. При 30-35оС разрушение клетчатки происходит медленнее. Разрушенные массы клетчатки подвергаются микроскопическому анализу. Готовят фиксированный препарат – окрашивание фуксином (Родина, 1968).
Маслянокислое брожение крахмала исследуют на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими 1/3 высокой пробирки, добавляют немного мела, заливают водопроводной водой на 2/3 и помещают в водяную баню при 80о на 19 мин для пастеризации. В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бактерий, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры. Элективные условия создают: крахмалом- источником углерода, используемым только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу; пастеризацией; анаэробиозом (высокий столбик жидкости в пробирке и выделение в процессе брожения СО2 и Н2, вытесняющих воздух). Через 2-3 дня картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. По окончании брожения культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых бактерий и качественного определения продуктов брожения.
Качественная реакция на масляную кислоту. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl3). Нейтральные растворы маслянокислых солей при нагревании с FeCl3 приобретают коричневое окрашивание вследствие образования маслянокислого железа. В пробирку наливают 3-5 мл сброженной жидкости, добавляют 1-2 мл 5%- ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению:
3Ca (CH3CH2CH2COO) 2 + 2Fe2Cl3 → 2Fe (CH3CH2CH2COO) 3 + 3CaCl2
Раствор маслянокислого железа в отраженном свете приобретает буровато-коричневое окрашивание, а в проходящем свете - кроваво-красное.
Техника посева культур микроорганизмов. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на твердых и жидких средах в пробирках, колбах или в чашках Петри.
Посевом в микробиологии называется внесение клеток микроорганизмов (посевного материала – инокулята) в стерильные среды.
Пересев- это перенос выращенной культуры микроорганизмов на питательной среде на другую свежую питательную среду.
Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.
Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. Пробирки при взятии мазка необходимо удерживать в наклонном положении, чтобы гарантировать стерильность культуры. Если их держать вертикально, то возможно попадание посторонних клеток микроорганизмов.
В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую петлю, держа ее в правой руке в отвесном положении. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью, пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и переносят во вторую пробирку.
Окраска клеток микроорганизмов по Граму. Метод дифференциации микробных клеток, основанный на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у других видов это соединение временно появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микробы первой группы называются грамположительными, второй - грамотрицательными.
Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них- контрольные с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклоненном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая ,96% -ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат окажется перекрашенным.
Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно - фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски (фуксина) (Теппер и др., 1987).
2.2 Модельные микроэкосистемы
Небольшие автономные «миры» или микрокосмы, в бутылях или других сосудах могут имитировать в миниатюре природу различных экосистем. Эти небольшие «миры» можно рассматривать как Микроэкосистемы. Создание небольших, полностью закрытых систем, нуждающихся в лишь одной световой энергии (своеобразные миниатюрные биосферы), - очень сложная задача. Экспериментальные микрокосмы обычно варьируют от частично закрытых систем, в которых происходит газообмен с атмосферой, но не происходит обмена биогенными элементами и организмами, до полностью закрытых систем, включающих сообщества организмов, содержащихся в различных хемостатах и турбидостатах с регулируемым притоком и оттоком биогенных элементов и организмов. В хорошо смоделированных микрокосмах можно наблюдать многие или даже почти все основные функции и трофические структуры природной экосистемы, однако в силу необходимости разнообразие и размеры компонентов таких микрокосмов крайне невелики. Преимущества микроэкосистем для исследователя заключаются в том, что они имеют четкие границы, легко воспроизводимы и удобны для экспериментов. Не следует, однако, думать, что микрокосмы представляют собой копии той или иной конкурентной экосистемы, это всего лишь живые работающие модели (упрощения) природы.
Можно выделить два типа биологических микрокосмов:1) микроэкосистемы, взятые непосредственно из природы путем множественного засева культуральной среды пробами из различных природных местообитаний, и 2) системы, созданные путем сочетания видов, выращенных в «чистых» или аксенических, культурах (свободных от других организмов), пока не получится желаемая комбинация. Системы первого типа – это, в сущности, «демонтированная» или «упрощенная» природа, сведенная к тем микроорганизмам, которые могут длительное время поддерживаться и функционировать в условиях выбранного экспериментатором сосуда, культуральной среды, освещенности и температуры. Такие системы, следовательно, обычно имитируют какие – то определенные природные ситуации. Одна из проблем, возникающая при работе с такими производными экосистемами, состоит в том, что трудно определить их точный видовой состав, особенно состав бактерий (denetal, 1969). Начало использованию в экологии производных или «множественных» систем положили работы Г. Одума и его учеников (H. Odum, Hoskins, 1957; Beyers, 1963).
При втором подходе путем подбора первоначально изолированных и тщательно изученных компонентов создается система с известным составом. Получаемые при этом культуры часто называют гнотобиотическими (этот термин обсуждается в работе Догерти (Dougherty, 1959)), поскольку здесь точно известен состав и даже то, присутствуют или отсутствуют бактерии. Гнотобиотические культуры прежде использовали главным образом для изучения питания, биохимии и других аспектов жизни отдельных видов и штаммов или для изучения взаимодействия двух видов. Однако в последнее время экологи начали экспериментировать с более сложными полиаксеническими культурами в поисках путей построения автономных экосистем (Nixon, 1969; Taub, 1969, 1974).
Эти два противоположных подхода к созданию лабораторных микроэкосистем параллельны двум давно существующим подходам (холистическому и мерологическому) экологов к изучению озер и других больших систем, существующих в природе.
Существует широко распространенное заблуждение относительно «равновесия» в аквариуме с рыбами. Вполне возможно достигнуть некоторого приблизительного равновесия газового и пищевого режима при условии, что в нем мало рыб, а воды и растений много. Еще в 1851 г. Дж. Уорингтон «установил это удивительное и восхитительное равновесие между животным и растительным царствами» в аквариуме объемом 12 галлонов (54,6 л), поселив в нем несколько золотых рыбок, улиток и большое количество валлиснерии (водное растение), а с ними и множество разнообразных микроорганизмов. Уорингтон правильно оценил не только взаимодействие рыб и растений, но и отметил значение детритоядных улиток «в разложении остатков растений и водорослевой слизи», в результате чего «то, что иначе могло бы действовать как ядовитое начало, превращается в плодородную среду для роста растений». Большинство попыток любителей добиваться равновесия в аквариуме терпит неудачу из-за того, что для наличного количества ресурсов в аквариум помещают слишком много рыб (диагноз: элементарный случай перенаселения). Для полного самообеспечения одной рыбе среднего размера требуется много кубических метров воды и организмов, служащих пищей. Поскольку аквариум обычно держат дома, на работе или в школе ради «наблюдения за рыбами», помещая большое число рыб в малом пространстве, необходимо дополнительное питание, аэрация и периодическая очистка аквариума (Одум, 1986).
В данной работе была проведена постановка двух модельных микроэкосистем. В одной системе исследовалось влияние микрофлоры реки Кривая Болда на микробиологический состав садовой почвы. Во второй микроэкосистеме наблюдалось влияние микрофлоры озера Баскунчак на микробиологический состав садовой почвы.