БИОТЕХНОЛОГИЯ
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА УРОВНЯ ВКЛЮЧЕНИЯ ДЕЙТЕРИЯ И УГЛЕРОДА-13 В МОЛЕКУЛЫ АМИНОКИСЛОТ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ
@ О. В. МОСИН
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, г. Москва, просп. Вернадского, д.86
Методом высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара исследованы уровни включения стабильных изотопов дейтерия 2H и углерода-13 13С в молекулы секретируемых аминокислот L-фенилаланинпродуцирующего штамма Brevibacterium methylicum и L-лейцинпродуцирующего штамма Methylobacillus flagellatum и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы при выращивании бактерий на средах, содержащих в качестве источников стабильных изотопов (2Н)метанол, (13С)метанол и 2Н2О. Также осуществлено включение L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланина, L-[3,5-2Н]тирозина и L-[2,4,5,6,7-2Н]триптофана в бактериородопсин, синтезируемый Halobacterium halobium ЕТ 1001. Для масс-спектрометрического анализа мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральных жидкостей и белковых гидролизатов (гидролиз в 6 М 2НСl (3% фенол) и 2 М Ва(ОН)2), превращали в N-бензилоксикарбонил-производные аминокислот и метиловые эфиры N-диметиламинонафталин-5-сульфонил-производных аминокислот, которые препаративно разделеляли методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии. Полученные [2H]- и [13C]аминокислоты представляли собой смеси, различающиеся количеством включённых в молекулу изотопов. Уровни включения 2Н и 13С в молекулы секретируемых аминокислот и аминокислотные остатки суммарных белков биомассы меняются в зависимости от содержания меченых субстратов в ростовых средах и различаются для разных аминокислот (до 10% для L-лейцина/изолейцина и до 97.5% для L-аланина).
Ключевые слова: стабильные изотопы; метилотрофные бактерии; галофильные бактерии; выращивание на 2Н2О; изотопномеченые аминокислоты, бактериородопсин
Обогащение молекул стабильными изотопами (2Н, 13С, 15N и другие) в настоящее время является важным методом в разнопрофильных биохимических и метаболических исследованиях с использованием аминокислот и других биологически активных соединений (БАС) [1-3]. Тенденции к предпочтительному применению стабильных изотопов по сравнению с их радиоактивными аналогами обусловлены отсутствием радиационной опасности и возможностью определения локализации метки в молекуле методами высокого разрешения, включая ЯМР [4], ИК- [5] и лазерную спектроскопию [6] и масс-спектрометрию [7]. Развитие этих методов детекции стабильных изотопов за последние годы позволило повысить эффективность биологических исследований, а также изучать структуру и механизм действия клеточных БАС на молекулярном уровне [8, 9]. В частности, аминокислоты, меченные 2Н, 13С, 15N с различными уровнями изотопного включения, применяются для изучения пространственной структуры и конформационных изменений белков [10], взаимодействия белковых молекул [11], а также в химических синтезах широкого круга изотопномеченых соединений на их основе. Например, меченый L-фенилаланин использован в синтезах пептидных гормонов и нейротрансмиттеров [12].
Важным моментом в исследованиях с применением меченых аминокислот, является их доступность. Изотопномеченые аминокислоты могут быть получены с использованием химических, ферментативных и биосинтетических методов. Однако химические синтезы часто многостадийны, требуют больших расходов ценных реагентов и меченых субстратов и приводят в результате к продукту, представляющему собой рацемическую смесь D- и L- форм, для разделения которых требуются специальные методы [13]. Более тонкие синтезы меченых аминокислот связаны с использованием комбинации химических и ферментативных подходов [14-16].
Для многих целей и прежде всего для структурных исследований белков биотехнология предлагает альтернативный химическому синтезу путь получения аминокислот, меченных стабильными изотопами, который приводит к высоким выходам синтезируемых продуктов, к эффективному включению изотопов в молекулы, и, самое главное, к сохранению природной конфигурации синтезируемых соединений. При биосинтетическом получении меченых аминокислот используют несколько подходов, один из которых заключается в равномерном обогащении синтезируемых соединений по всему углеродному скелету молекулы за счёт выращивания штаммов продуцентов на средах, содержащих в качестве источников стабильных изотопов следующие субстраты: 15NН4Сl [17], (13С)метанол, (2Н)метанол [18], и 2Н2О [19]. Этот подход включает в себя также комплексное использование химических компонентов биомассы, выращенной в присутствии стабильных изотопов, для выделения и фракционирования нужных изотопномеченых соединений. Другой подход заключается в сайт-специфическом обогащении аминокислот по определённым положениям молекул за счёт ассимиляции клеткой меченых предшественников, например, [1,4- 13С]сукцината, [1, 2- 13С]ацетата, [1- 13С]лактата и др. [20, 21]. Методы получения изотопномеченых аминокислот в аспекте их использования для ЯМР-исследований белков более подробно изложены в работах ЛеМастера [22].
Настоящая работа является продолжением исследований [23-25], направленных на биосинтетическое получение [2Н]- и [13С]аминокислот за счёт утилизации низкомолекулярных меченых субстратов - (2Н)метанола, (13С)метанола и 2Н2О в клетках микроорганизмов и реализацию возможности определения стабильных изотопов методом масс-спектрометрии электронного удара. Чувствительность масс-спектрометрии составляет 10-9-10-11 нмоль, что существенно выше, чем при использовании ИК- и ЯМР-спектроскопии. Данный метод в сочетании с обращённо-фазовой ВЭЖХ хорошо зарекомендовал себя для исследования уровня изотопного обогащения молекул аминокислот в составе их мультикомпонентных смесей, каковыми являются препараты культуральных жидкостей штаммов-продуцентов аминокислот и гидролизаты белков, полученные со сред, содержащих стабильные изотопы.
Объектами исследования служили полученные в результате мутагенеза L-фенилаланинпродуцирующий штамм факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum, ассимилирующий метанол по рибулозо-5-монофосфатному пути фиксации углерода, и L-лейцинпродуцирующий штамм облигатных метилотрофных бактерий Methylobacillus flagellatum, реализующий 2-кето-3-дезоксиглюконатальдолазный вариант рибулозо-5-монофосфатного пути фиксации углерода. Для компенсации ауксотрофности по L-лейцину и L-изолейцину эти аминокислоты добавляли в ростовые среды в протонированном виде. При этом уровни накопления L-фенилаланина и L-лейцина в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов достигали величины 0.8 и 1.0 г/л соответственно [23]. Включение дейтерия в молекулы секретируемых аминокислот и суммарных белков биомассы осуществляли за счёт выращивания штамма B. methylicum на средах с 2Н2О и обычным метанолом, так как уровень включения 2Н в молекулы аминокислоты за счёт ассимиляции (2Н)метанола незначителен [25].
Поскольку в клетке происходит ассимиляция водорода (дейтерия) из Н2О (2Н2O)среды, мы подбирали условия включения дейтерия в молекулы аминокислот и белков при ступенчатом возрастании концентрации 2Н2O в ростовых средах, как показано в табл. 1. Рост бактерий на 2H2O-cодержащих средах характеризуется увеличением продолжительности лаг-фазы, времени клеточной генерации и снижением выходов микробной биомассы (табл. 1), поэтому было необходимо проводить адаптацию бактерий к 2Н2О. Метод адаптации штамма B. methylicum к росту на 2Н2О при сохранении способности к биосинтезу L-фенилаланина описан в работе [23]. В данной работе были исследованы образцы культуральной жидкости B. methylicum и гидролизаты биомассы, полученные в ходе многоступенчатой адаптации бактерий к тяжёлой воде на средах с различным содержанием 2Н2О (от 24.5 до 98% 2Н2О*). Поскольку данный штамм метилотрофных бактерий удалось адаптировать к росту на 2Н2О, исследование уровней включения дейтерия в молекулы аминокислот представлялось наиболее интересным.
В отличие от культивирования на 2Н2О-среде, где необходимо проводить клеточную адаптацию к дейтерию, при получении [13С]аминокислот за счет утилизации 13СН3ОН данный этап не является обязательным, поскольку этот изотопный субстрат не оказывает негативного биостатического эффекта на ростовые характеристики метилотрофов (см. табл. 1). Поэтому в случае M.flagellatum включение 13С в молекулы аминокислот осуществляли в одну стадию при выращивании бактерий на водных средах, содержащих 1% (13C)метанол.
Таблица 1
Влияние изотопного состава среды на рост штаммов B. methylicum и M. flagellatum
| Номер опыта | Среда выращивания | Величина лаг-фазы, ч | Выход биомассы, % от контроля | Время генерации, ч |
| 1 | 0 | 24.0 | 100 | 2.2 |
| 2 | 24.5 | 32.1 | 90.6 | 2.4 |
| 3 | 49.0 | 40.5 | 70.1 | 3.0 |
| 4 | 73.5 | 45.8 | 56.4 | 3.5 |
| 5 | 98.0 | 60.5 | 32.9 | 4.4 |
| 6 | CН3ОН | 0 | 100 | 1.1 |
| 7 | 13СН3ОН | 0.1 | 72.0 | 1.0 |
В качестве другой модельной системы для включения изотопной метки в молекулы белков, использовали бактериородопсин [26], синтезируемый в мембране Halobacterium halobium ЕТ 1001. Выбор для этих целей бактериородопсина, функционирующего как АТP-зависимая транслоказа в клетках галофильных бактерий, был продиктован возможностью исследования с его помощью процессов функционирования мембранных белков in vivo в условиях изотопного обогащения среды дейтерием. Для включения дейтериевой метки в молекулу бактериородопсина использовали метод сайт-специфического обогащения белка за счёт выращивания H. halobium ЕТ 1001 на синтетической среде с дейтерийсодержащими аналогами ароматических аминокислот - L-[2,3,4,5,6-2Н]фенилаланином, L-[3,5-2Н]тирозином и L-[2,4,5,6,7-2Н]триптофаном.