Клеточная биотехнология (стр. 2 из 9)
Геноконтролируемые этапы являются критическими периодами в развитии биологической системы, поскольку именно здесь происходят коренные изменения, связанные с формированием морфофункциональной структуры и определение принципов регулирования. В эти периоды создаются предпосылки негеноконтролируемых переходов системы, в которых она сохраняет свои качественные характеристики и свойства, а также демонстрирует низкую чувствительность к внешним и внутренним изменениям условий развития.
Итак, дифференцировкой можно назвать процесс изменения профиля генной активности, приводящий к дальнейшему изменению функции клеток.
В эмбриологии животных процесс дифференцировки изображают как сложный «ландшафт», по которому катится «шар». Шар — это символ клетки, дающей начало новому организму. В развилках шар «совершает выбор» и скатывается по одной из нескольких возможных траекторий. Так и клетки, возникшие при делении зиготы, направляются по одному из возможных путей дифференцировки. При этом клетки теряют «морфогенетический потенциал». Все «траектории» заканчиваются в «море», символизирующем смерть организма.
Если в начале пути у «шара» - клетки много потенциальных возможностей, то по мере приближения к «морю» их становится все меньше.
По имени ученого, предложившего такую аналогию, ее называют морфогенетическим ландшафтом Уоддингтона.
Процесс дифференцировки равносилен потере морфогенетического потенциала.
В отличие от клеток животных большинство клеток растений после анатомической дифференцировки легко переходят к делению. Такой процесс называют дедифференцировкой (потерей специализации). При механическом повреждении растения, а также в условиях эксперимента дедифференцировка приводит к образованию каллуса.
Из большинства клеток можно получить новый организм (для клеток животных это невозможно). Практически любая клетка многоклеточного организма содержит полный набор генов, необходимый для формирования организма, однако не каждая клетка может дать начало целому организму. Свойство клетки реализовать имеющуюся генетическую информацию и дать начало целому организму называют тотипотентностью. Тотипотентность клеток растения сравнительно легко реализовать, тогда, как большинство животных клеток не могут образовать новый организм. Таким образом, понятие дифференцировки как снижения морфогенетического потенциала, заимствованное из эмбриологии животных, не применимо к тотипотентным растительным клеткам, так как их морфогенетический потенциал долго остается высоким.
Идея о тотипотентности растительной клетки была выдвинута Г. Хаберландтом еще в 1902 г., хотя и не получила тогда экспериментального подтверждения. Согласно определению Хаберландта, любая клетка растения может дать начало новому организму, и если этого не наблюдается, то только потому, что растительный организм подавляет потенции клетки к развитию. Изоляция клеток от растений способствует проявлению этих потенций.
Культура каллусных тканейи их морфогенетические особенности
Культура изолированных тканей обычно бывает представлена каллусными или опухолевыми тканями. Каллусная культура – это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из недифференцированных клеток. В дальнейшем они специализируются как каллусные. Каллус может образовываться как на изолированных участках ткани (эксплантах) invitro, так и на растении при повреждении.
Каллусная ткань invitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зелёного цвета (полная или зональная пигментация антоцианами). Тёмно-коричневая окраска возникает при старении каллусных клеток и вызвана накоплением в них фенолов. Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть различной консистенции:
1. Рыхлая, состоящая из сильно оводнённых клеток, легко распадающиеся на отдельные агрегаты.
2. Средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами.
3. Плотная, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы.
Обязательным условием дифференцировки растительной клетки и превращение её в каллусную является присутствие в питательной среде двух групп антагонистических гормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процессы дифференцировки клетки, запуская механизмы активизации вторичных мессенджеров, способствующих растяжению клеточных стенок и дальнейшую пролиферацию, а цитокинины вызывают деление уже дифференцированных клеток. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходим «возврат» к меристематическому состоянию (дедифференцировка). Размножение дифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией митозов, способность к которому была потеряна в процессе дифференцировки.
Эффект, вызываемый действием одних и тех же фитогормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Её компетентность определяется степенью дифференцировки клеток.
Переход клетки invitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у однодольных. При переходе дедифференцированной клетки к неорганизованному анархическому размножению, приводящему к образованию каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические изменения. Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл. Через 6—12 ч после индукции дедифференцировки клеточная оболочка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, возрастает число элементов аппарата Гольджи, увеличиваются размеры и число ядрышек. Все эти изменения предшествуют началу делений, которые начинаются через 48-72 часа.
Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Каллусную дифференцировку можно назвать вторичной, но её не следует путать с вторичной дифференцировкой клетки, лежащей в основе морфогенеза. Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирание каллусных клеток, первичный каллус, возникший на эксплантах, через 4-6 недель переносят на свежую питательную среду – пассируют. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение нескольких лет.
Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму (рис.1). Данный график включает пять фаз. Во время первой – латентной фазы увеличения числа и массы клеток не происходит. Клетки в этот период подготавливаются к делению. Вторая фаза - период экспоненциального роста, характеризующаяся наибольшей митотической активностью и увеличением массы каллусной культуры. Кроме того, рост здесь происходит с ускорением. Третья фаза – линейная, где скорость роста клеток относительно постоянна. Далее наступает фаза замедленного роста, при которой митотическая активность клеток резко снижается. И пятая фаза – стационарная или период деградации. Скорость нарастания клеточной массы здесь равна нулю.
На электронно-микроскопических фотографиях показана тонкая структура молодой, растущей и стареющей клетки каллусной ткани:
а – молодая
б - растущая
в - стареющая
Успех в применении культуры клеток и тканей в первую очередь зависит от оптимизации физиологических процессов, обеспечивающих нормальную пролиферацию, их дифференцировку и регенерацию из них взрослых особей. Наиболее сложной является регенерация растений из отдельных клеток. В первую очередь это касается злаковых растений. Поэтому важнейшее значение имеет выяснение механизма морфогенеза invitro, регенерация и лежащих в их основы процессов.
Каллусные клетки invitro сохраняют многие физиолого-биохимические черты, свойственные нормальным клеткам, входящим в состав растительного организма. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных метаболитов. Морозостойкость и способность к закаливанию присущи каллусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим свойством не обладают каллусные ткани, полученные от тропических и субтропических культур. Таким образом, устойчивость к низким температурам сохраняется при переходе клетки к каллусному росту. Каллусным тканям свойственна и фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности фитохромов. Общим у каллусные и нормальных клеток растения является и еще ряд признаков, в частности, устойчивость к действию высоких температур, осмотически активных веществ, засолению.