Клеточная биотехнология (стр. 8 из 9)
Ауксины: ИУК – b-индолил-3-уксусная кислота, ИМК – индолил-3-мас-ляная кислота, НУК – a-нафтилуксусная кислота, 2,4-Д – 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.
Цитокинины: кинетин – 6-фурфуриламинопурин, зеатин, NN-дифенил-мочевина, 6-БАП – 6-бензиламинопурин.
Гиббереллины: гиберрелловая кислота.
В качестве биологических добавок для индукции первичного каллуса можно использовать растительные экстракты (10-15 % от общего объёма среды): кокосовое молоко (жидкий эндосперм кокосового ореха), вытяжки из незрелых зерновок кукурузы (лучше в период молочной спелости), которые содержат цитокинины – кинетин и зеатин (6-ти замещенные аминопурины) и NN-дифенилмочевину.
В культуре in vitro применяют жидкие и агаризованные (твердые) среды. Жидкие среды используются для культивирования суспензий, каллусов, изолированных органов и тканей, растений - регенерантов. При этом для поддержания эксплантов в пробирки со средой помещают специальные мостики - поддержки из фильтровальной бумаги или синтетических пористых материалов.
Агаризованные среды готовят на основе агар-агара – полисахарида, входящего в состав морских водорослей, который образует с водой гель при pH 5,6-6,0. иногда в качестве уплотнителя и заменителя агар-агара используют полиакриламидные гели (биогели) P10 и P200.
Для искусственных питательных сред растворы макро- и микросолей готовят заранее и используют многократно. Это маточные (концентрированные) растворы. Их хранят в специальных условиях: макро- и микросоли в холодильнике в сосудах с притертыми пробками при 0…+4оС; витамины, фитогормоны, ферменты, растительные экстракты – при -20оС в небольших по 5-10 мл сосудах с пробками (пеницилловые флаконы).
Маточные растворы макросолей обычно превосходят рабочие по концентрации в 10-40 раз, микросолей – в 100-1000 раз, витаминов – в 1000 раз.
Растворы фитогормонов желательно готовить непосредственно перед работой со средами.
Для приготовления маточного раствора макро- и микросолей каждую соль растворяют в отдельном стаканчике при нагревании, затем сливают и доводят до нужного объема. В охлажденную смесь микросолей последним добавляют раствор солей молибдена, а в макросоли – раствор солей магния (для предотвращения выпадения осадка).
Маточные растворы хлористого кальция и хелата железа (сернокислое железо + ЭДТА, либо Na ЭДТА – трилон Б) готовят и хранят отдельно от других солей.
Концентрированные растворы витаминов готовят следующим образом: 10-кратные навески растворяют в 10 мл дистиллированной воды каждый отдельно.
Фитогормоны – это вещества, которые плохо растворяются в воде. Поэтому предварительно 100 мг вещества растворяют в небольших количествах (0,5-2,0 мл) спирта (ауксины, гиббереллины), 0,5-1н HCl или КОН (цитокинины), затем подогревают до полного растворения (кроме абсцизовой кислоты и кинетина) и доводят до 100 мл объема (1 мл содержит 1 мг вещества).
В таблице представлен состав наиболее часто используемых питательных сред. Как правило, начиная работать с новым объектом, исследователи модифицируют состав стандартных сред, особенно часто варьируя концентрации и набор органических компонентов.
Частные примеры питательных сред.
Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга.
| № п.п. | Компонент среды | Количество вещества |
| Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора) | ||
| 1.2.3.4. | KNO3NH4NО3KH2PO4MgSO4. 7H2Oили MgSO4 безводный | 38333,47,43,6 |
| 5. | CaCl2. 2H2Oили CaCl2 безводный | 8,86,65 |
| Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора) | ||
| 6.7.8.9.10.11.12. | Na2MoO4. 2H2OCuSO4. 5H2OH3BO3MnSO4. 5H2Oили MnSO4. 4H2OZnSO4.7H2OKJCoCl2. 6H2O | 252,562024102230860832,5 |
| 13. | FeSO4Na2ЭДТА | 557745 |
Среда Мурасиге-Скуга (М-С) для клеточных и тканевых культур
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaCl2Тиамин-HClПиридоксин-HClНикотиновая кислотаМезоинозитГлицинСахароза | 50 мл/л1 мл/л5 мл/л50 мл/л0,1 мг/л0,5 мг/л0,5 мг/л100 мг/л2 мг/л30 г/л |
| рН 5,6-5,8 | |
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования апикальных меристем картофеля
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaCl2Тиамин-HClПиридоксин-HClВитамин В12Никотиновая кислотаФолиевая кислотаМезоинозитГидролизат казеинаАденинПантотенат СаРибофлавинБиотинАктивированный угольГККинетинСахарозаГлюкозаАгар-агар | 50 мл/л1 мл/л5 мл/л50 мл/л1 мг/л1 мг/л0,015 мг/л2 мг/л0,5 мг/л100 мг/л1 г/л40 мг/л10 мг/л0,5 мг/л1 мг/л10 г/л2 мг/л0,5 мг/л20 г/л20 г/л7 г/л |
| рН 5,7-5,8 | |
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для микроразмножения картофеля черенкованием побегов
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaCl2Тиамин-HClПиридоксин-HClНикотиновая кислотаАденинКинетинГибберелловая кислотаПантотенат Са | 50 мл/л1 мл/л5 мл/л50 мл/л1 мг/л1 мг/л2 мг/л40 мг/л0,5 мг/л2 мг/л10 мг/л |
| Активированный угольСахарозаАгар-агар | 10 г/л30 г/л7 г/л |
| рН 5,8 | |
Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега.
| № п.п. | Компонент среды | Количество вещества |
| Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора) | ||
| 1.2.3.4. | KNO3(NH4)2SO4MgSO4. 7H2ONaH2PO4.H2O | 602,6810,03,0 |
| 5. | CaCl2. 2H2O | 3,0 |
| Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора) | ||
| 6.7.8.9.10.11. | Na2MoO4. 2H2OCuSO4. 5H2OH3BO3MnSO4.H2OZnSO4. 7H2OCoCl2. 6H2O | 257,530010002002,5 |
| 12. | FeSO4Na2ЭДТА | 557745 |
Среда Гамборга-Эвелега
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaCl2Тиамин-HClПиридоксин-HClНикотиновая кислотаМезоинозит2,4-ДСахароза | 50 мл/л1 мл/л5 мл/л50 мл/л10 мг/л1 мг/л1 мг/л100 мг/л2 мг/л20 г/л |
| рН 5,8 | |
Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для клубнеобразования у картофеля.
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaCl2Тиамин-HClПиридоксин-HClНикотиновая кислотаАскорбиновая кислотаКинетинСахарозаАгар-агар | 50 мл/л1 мл/л5 мл/л50 мл/л1 мг/л0,5 мг/л0,5 мг/л1 мг/л0,5 мг/л50 г/л7 г/л |
| рН 5,8-6,0 | |
Приготовление маточных растворов для среды Блейдза.
| № п.п. | Компонент среды | Количество вещества |
| Маточный раствор макросолей (г на 1 л маточного раствора) | ||
| 1.2.3.4.5. | KNO3KClKH2PO4NH4NO3MgSO4.7H2Oили MgSO4 безводный | 201,36201,440,7 |
| 6. | Ca(NO3)2. 4H2O | 10,28 |
| Маточный раствор микросолей (мг на 100 мл маточного раствора) | ||
| 7.8.9.10. | H3BO3MnSO4. H2Oили MnSO4.5H2OZnSO4.7H2OKJ | 16044062715080 |
| 11. | FeSO4Na2ЭДТА | 557745 |
Среда Блейдза для каллусогенеза.
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaNO3Тиамин-HClПиридоксин-HClНикотиновая кислотаАскорбиновая кислотаМезоинозит2,4-ДСахарозаАгар-агар | 50 мл/л1 мл/л5 мл/л50 мл/л0,5 мг/л0,5 мг/л1 мг/л1 мг/л0,1 г/л2 мг/л20 г/л7 г/л |
| рН 6,0 | |
Среда Блейдза для соматического эбриогенеза.
| Компоненты питательной среды | |
| Маточный раствор макросолейМаточный раствор микросолейFe-хеллатCaNO3Тиамин-HClПиридоксин-HClНикотиновая кислотаАскорбиновая кислотаМезоинозитИУККинетинАБКСахарозаАгар-агар | 50 мл/л1 мл/л2,5 мл/л50 мл/л0,5 мг/л0,5 мг/л1 мг/л1 мг/л0,1 г/л0,2 мг/л0,2 мг/л0,05 мг/л20 г/л7 г/л |
| рН 6,0 | |
Способы стерилизации в биотехнологии
Все работы с культурой клеток и тканей in vitro проводят в стерильных (асептических) условиях в стерильном боксе или ламинар-боксе, стерильными инструментами, в стерильной посуде, на стерильных питательных средах. В случае нарушения стерильности на средах хорошо развиваются микроорганизмы (грибы, бактерии), нарушающие состав среды и подавляющие рост растительных эксплантов.
Чаще всего для стерилизации помещений (боксов для пересадки тканей, культуральных комнат) используют ультрафиолетовое облучение в течение 0,5-2 часов (в зависимости от площади помещения). Работы в облученном помещении начинают через 15-20 минут после отключения бактерицидных ламп, так как под действием ультрафиолетового излучения двухатомный кислород воздуха становится трехатомным озоном – газом, токсичным для человека. Для достижения максимальной стерильности перед обработкой УФ все поверхности тщательно отмываются моющими средствами, водой и растворами хлорсодержащих веществ, поверхности ламинар-бокса обрабатывают 96 % спиртом.