Смекни!
smekni.com

Активность основных карбокмипептидаз в тканях пренатально алкоголизированных крыс (стр. 5 из 19)

КПН существует в двух формах: растворимой и мембраносвязанной. Обе формы являются гликопротеинами. Они имеют идентичную субстратную специфичность и чувствительность к групп-специфичным реагентам. Растворимая форма КПН более активна, чем мембраносвязанная. Mr мембранной формы 55 000 – 57 000, Mr растворимой формы 53000 – 57000 [145, 188, 193, 200, 205, 206, 325, 330, 350]. Различия в молекулярной массе мембраносвязанной и растворимой форм КПН, по-видимому, связано с наличием у первой так называемого ”мембранного якоря”. С-концевая область мембраносвязанной КПН (51 аминокислотный остаток) образует амфифильную a-спираль, которая и может служить гидрофобным ”мембранным якорем” [166, 270, 338]. В секреторных гранулах КПН связывается с детергент-устойчивыми липидными доменами мембран, богатыми гликосфинголипидами и холестеролом [150]. Такая ассоциация КПН с мембранами является необходимым условием для выполнения сортирующей функции в регулируемом секреторном пути [150]. Растворимая и мембраносвязанная формы КПН вероятно отличаются механизмами, регулирующими их активность [33]. В настоящее время обнаружено несколько видов мембраносвязанной и растворимой форм фермента, отличающихся молекулярной массой, значением pI[37, 145, 286]. Соотношение мембраносвязанной и растворимой форм КПН в разных клетках и тканях отличается [161, 285]. По некоторым данным мембраносвязанная форма может переходить в растворимую при повышении рН [121, 318], при холестероловом истощении мембран [150]. По данным Frickerи Devi[167] в секреторных везикулах мембраносвязанная форма КПН может переходить в растворимую путем протеолитического удаления С-концевой последовательности КПН. Фермент, осуществляющий этот переход, активируется ионами кальция. Вероятно, превращение мембраносвязанной формы в растворимую может регулироваться ионами кальция [274], концентрация которых в клетке изменяется в ответ на различные стимулы, что, в свою очередь, влияет на секрецию нейропептидов [116]. С другой стороны, Parkinson [285, 286] высказывает сомнения относительно возможности перехода мембраносвязанной формы в растворимую посредством С-концевого протеолиза.

Ген КПН клонирован и секвенирован [110, 165, 219, 220, 253, 255, 300, 316]. В последовательности гена КПН присутствуют регуляторные участки, повышающие активность транскрипции [157, 218, 220, 237, 316], однако уровень мРНК препроКПН и нейропептидов коррелирует не всегда [170, 171, 187].

При мутации в гене, кодирующем КПН (единичная точечная мутация Ser202 на Pro), уменьшается эффективность процессинга прогастрина [236, 336], нарушается процессинг проинсулина (и нарушению внутриклеточного фолдинга КП Н) [139, 210, 273, 339, 340], синтеза соматостатина и хромогранина А [196], подавляется процессинг проглюкагона и глюкагон-подобного пептида 1 [175], происходит нарушение внутриклеточного транспорта проопиомеланокортина и гормона роста [311], созревания пронейротензина и промеланоцитстимулирующего гормона [303]. Это приводит к многочисленным эндокринным нарушениям, включая гиперинсулинемию и бесплодие [140, 243, 273]. У человека при диабете (T2DM) синтезируется КПН, кодированная мутантными генами, с измененными свойствами (рН оптимумом, субстратной спечифичностью) [137].

КПН синтезируется в виде неактивного предшественника с Mr 75000, состоящего из 476 аминокислотных остатков [206, 300, 319]. Затем он подвергается С- и N-концевому посттрансляционному процессингу [192, 201, 300].

Активность КПН в мозге и тканях коррелирует с уровнем мРНК КПН [124, 167] и в целом соответствуют распределению биологически активных пептидов и их предшественников [48, 163, 164]. Наиболее высокие уровни мРНК КПН обнаружены в передней и промежуточной долях гипофиза, хромафинных гранулах надпочечников, островках Лангерганса поджелудочной железы [108, 144, 151, 172, 173, 174, 193, 200, 207, 246, 251, 279, 285, 323, 330, 344]. Несколько ниже уровни мРНК КПН обнаружены в задней доле гипофиза, отделах мозга, слюнных железах [174, 246, 250, 285, 323, 330]. Наиболее низкие уровни выявлены в стволовой части головного мозга, спинном мозге, легких, сердце, желудочно-кишечном тракте, печени и почках [248, 249]. Фермент также обнаружен в центральных нейронах миндалины [246]. Тканевое и региональное распределение КПН сходно у разных видов животных и человека [168, 221]. Установлено, что КПН ассоциирована со структурными элементами эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи и секреторными везикулами, где протекает процессинг предшественников различных биологически активных пептидов [36, 163]. Имеются сведения о том, что эндоплазматический ретикулум и элементы комплекса Гольджи содержат мембранную форма КПН (57000), секреторные гранулы – растворимую форму кпн (54000) и мембранную [192]. В регуляторном секреторном пути КПН выполняет сортирующую функцию [139, 140, 183]. КПН участвует в процессинге многих регуляторных пептидов: опиоидных [35, 48, 56, 172, 174, 200, 204], пептидных гормонов гипофиза, гипоталамуса, желудочно-кишечного тракта, плаценты, фактора роста [35, 151, 200, 204, 292], пептидов, имеющих единого предшественника proSAAS[131, 160], пептидов (включая проэнкефалин, проопиомеланокортин, протахикинины А и В, хромогранин А и В, секретогранин), с образованием более 100 новых пептидов [136] и т. д.

Уровень мРНК КПН и активность фермента в культурах клеток способны изменяться в ответ на внешние воздействия: при смене условий освещенности [308]; под действием фактора роста нервов [144, 187, 237, 283, 335]; раствора KCl [144, 170]; бромкриптина [283]; дексаметазона [39, 300]; кортикотропин-рилизинг-фактора [253, 300]; гидрокортизона [39]. Кратковременная общая ишемия снижает, а длительная повышает активность КПН и уровень ее мРНК в гипоталамусе и коре крыс [213]. Однократный эмоционально-болевой стресс вызывает повышение карбоксипептидазно-Н-подобной активности в гипофизе и сыворотке крыс, длительный – повышение в гипофизе и снижение в сыворотке [45]. Активность КПН через 6 часов введения этанола (в дозе 4 г/кг) повышается в гипофизе и снижается в сыворотке, через 18 часов – повышается в гипофизе и сыворотке [45]. Длительное воздействие эмоционального стресса, этанола и транквилизаторов (диазепама и резерпина) повышает активность КПН в гипофизе, гипоталамусе и стриатуме крыс [341]. В некоторых отделах головного мозга крыс совместное воздействие этанола и стресса вызывает гиперактивацию КПН, причем изменение активности зависит от дозы этанола и вида стрессирующего воздействия [32]. Отмечается различие в региональной активности КПН мозга и периферических тканей у крыс с различным влечением к этанолу [54], и у мурицидных и немурицидных крыс [53]. Отмечается повышение активности КПН у немурицидных крыс при потреблении этанола и его отмене [53]. Таким образом, показано вовлечение КПН в определение агрессивности [52], в ответ на различные стрессирующие воздействия [29, 30, 49, 50, 52], введение гормонов [39] и транквилизаторов [187, 341], предрасположенности к потреблению этанола [54], в развитие физической зависимости от него [17, 44, 53].

Имеются также данные о половых отличиях в активности КПН [101]. Половые гормоны влияют на активность КПН в отделах гипоталамо-гипофизарно-надпочечниково-гонадной системы мышей: активность фермента у контрольных животных у самок выше, чем у самцов; экзогенно вводимые тестостерон и прогестерон по-разному снижают активность КПН в тканях животных разного пола [88].

Вовлечение КПН в формирование алкогольной зависимости [17, 32, 44, 45, 53, 54, 341], его участие в процессинге многих биологически активных пептидов [35, 48, 56, 131, 136, 151, 160, 172, 174, 200, 204, 292] обусловливают интерес к исследованию активности данного фермента и его участия в формировании толерантности к этанолу и предрасположенности к алкоголизму в постнатальном периоде у животных, испытавших пренатальное воздействие этанола.

1.3.3. ФМСФ-ингибируемая карбоксипептидаза

Первые упоминания о существовании фермента, отщепляющего аргинин и лизин с С-конца пептидов, но в то же время отличающегося от всех известных металлокарбоксипептидаз, относятся к 1993 году. Более подробные сведения появились в 1995 году [40, 41].

Фенилметилсульфонилфторид-ингибируемая карбоксипептидаза (ФМСФ-КП) – экзопептидаза, отщепляющая остатки основных аминокислот с С-конца пептидов. В частности, она отщепляет остаток аргинина от дансил-Phe-Leu-Arg [40], Cbz-Gly-Gly-Arg, Met5-энкефалина-Arg6 [47] с образованием, соответственно, дансил-Phe-Leu, Cbz-Gly-Gly, Met5-энкефалина. Дальнейшего расщепления образовавшихся продуктов не происходит. Фермент имеет Mr100000 – 110000 и проявляет максимальную активность при pH 5,0-6,0 [40]. Фенилметилсульфонилфторид и п-хлоромеркурбензоат полностью ингибируют его. Иодоацетамид снижается карбоксипептидазную активность только на 40%. Другой реагент на SH-группы (N-этилмалеимид), хелатирующий агент ЭДТА и специфический ингибитор КПН ГЭМЯК, а также ионы Co2+ не оказывают влияния на активность фермента. ФМСФ-КП инактивируется при нейтральных и слабощелочных значениях pH, но стабилизируется NaCl [40]. Km для синтетических субстратов дансил-Phe-Leu-Arg и дансил-Phe-Ala-Arg равна 48 и 96 мМ, соответственно.

ФМСФ-КП по своим физико-химическим свойствам схожа с лизосомальной карбоксипептидазой А (лизосомальная КПА, катепсин А, КФ 3. 4. 16. 1), но отличается от нее субстратной специфичностью и распределением активности в тканях и отделах мозга [127, 147, 195, 256, 257, 262, 289].

Тканевое и региональное распределение ФМСФ-КП имеет некоторые видовые отличия [38, 42, 43, 101, 102], но наибольшая активность у всех исследованных видов животных (ежа европейского, кошки, крысы, мыши) отмечена в надпочечниках и гипофизе [38, 42, 43, 88, 101, 102]. В отделах головного мозга активность ФМСФ-КП ниже, чем в периферических тканях и еще ниже, чем в гипофизе [38, 42, 43, 88]. Предполагается, что разных тканях ФМСФ-ингибируемая КП может быть представлена разными изоферментами. Поэтому выявленные отличия могут быть обусловлены разными соотношениями изоферментов у животных разных видов [43]. В мозге наибольшая активность фермента отмечается в отделах с преобладанием серого вещества (обонятельных луковицах, больших полушариях) или с высоким содержанием нейропептидов (гипоталамусе, стриатуме).