Антиатеросклеротическое действие смеси масел льна и расторопши с селенопираном (стр. 4 из 6)
Вычисление результатов измерения: Перекисное число Х в миллимолях активного кислорода на килограмм пробы вычисляют по формуле
Х = (V1-V0)*c*1000 \ m
V0–объем раствора тиосульфата натрия, использованный при контрольном измерении, см3
V1 -объем раствора тиосульфата натрия, использованный при измерении, см3
C– концентрация использованного раствора тиосульфата натрия моль\дм3
1000 – коэффициент учитывающий пересчет результата измерения в ммоль\кг
m – масса испытуемой пробы, г
За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных измерений.
2.3.3. Определение концентрации общего холестерина (ХСобщ) в сыворотке и плазме крови энзиматическим колориметрическим методом
ПРИНЦИП МЕТОДА. При гидролизе ЭХС холестеразой образуется свободный ХС. Образуется и имеющийся в пробе ХС: окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием (РОД) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации в пробе.
Наборреагентов: CHOLESTEROL «E – D» («Vital-Diagnostics»)
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
| Реагенты | Опытные пробы,(мл.) | Калибровочные пробы, (мл.) | Контрольные пробы, (мл.) |
| Сыворотка или плазма | 0,02 | _ | _ |
| Физ. Раствор (H2O) | _ | _ | 0,02 |
| Реагент 2 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Раствор холестерина | _ | 0,02 | _ |
Реакционную смесь перемешивают и инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре (20-25°С) или при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.
Расчет концентрации холестерина проводят по формуле:
С = [Ео/Ест ] * 5,17 (ммоль/л) или С =[ Ео/Ест ] * 200 (мг/100 мл)
Ео и Ест – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.
2.3.4. Определение концентрации триглицеридов (ТГ) в сыворотке и плазме крови энзиматическим колориметрическим методом
Тглицериды липаза глицерин + жирная кислота 
Глицерин + АТФ глицерокиназа глицерил-3-фосфат +2 H2O 
Глицерил-3-фосфат + O2ГФО диоксиацетон фосфат +2 H2O 
H2O2 + 4-ААР + 4-хлорфенол пероксидаза хинонимин + 4H2OНаборреагентов: TRIGLYCERIDES «E – D» («Vital-Diagnostics»)
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
| Реагенты | Опытные пробы, (мл.) | Калибровочные пробы, (мл.) | Контрольные пробы, (мл.) |
| Сыворотка или плазма | 0,02 | _ | _ |
| Физ. Раствор (H2O) | _ | _ | 0,02 |
| Реагент | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Стандартный раствор | _ | 0,02 | _ |
Реакционную смесь перемешивают и инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре (20-25°С) и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 505 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее часа после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света. (таблица).
Расчет концентрации триглицеридов проводят по формуле:
С = [Ео/Ест *250] – 10 (мг/100мл) или С = [Ео/Ест *2,85] – 0,11ммоль/л
Ео и Ест – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы. 10 мг/100мл (0,11ммоль/л) – поправка на содержание свободного глицерина в сыворотке (плазме крови).
2.3.5. Определение концентрации ХС-ЛВП (холестерина-липопротеидов высокой плотности) (HDL) в сыворотке и плазме крови
ПРИНЦИП МЕТОДА.Хиломикроны, липопротеиды низкой плотности (LDL) и липопротеиды очень низкой плотности (V LDL) осаждаются при добавлении к образцу фосфовольфрамат/Mg²+. После центрифугирования в супернатанте остаются толькоHDL, концентрация которых определяется так же как концентрация общего холестерина.
Наборреагентов: HDL CHOLESTEROL «FL - E» («Vital-Diagnostics»)
ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
1. Преципитация
| Реагенты | Опытные пробы, (мл.) | Калибровочные пробы, (мл.) | Контрольные пробы, (мл.) |
| Сыворотка или плазма | 0,15 | _ | _ |
| H2O | _ | _ | 0,15 |
| Осаждающий реагент | 0,3 | 0,3 | 0,3 |
| Раствор холестерина | _ | 0,15 | _ |
Хорошо перемешать и оставить на 10 мин при комнатной температуре. Опытные пробы отцентрифугировать в течение 10 мин при 4000g или 1-2 мин 1000g. Прозрачный супернатант использовать для определения концентрации HDL. Калибровочные и контрольные пробы центрифугировать не нужно. Определение холестерина во всех пробах в течение часа.
2. Определение концентрации HDL
| Реагенты | Опытные пробы, (мл.) | Калибровочные пробы, (мл.) | Контрольные пробы, (мл.) |
| Супернатант | 0,2 | _ | - |
| H2O+ реагент №1 | _ | _ | 0,2 |
| Рабочий реагент для определ. холестерина | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Раствор холестерина+реагент №1 | _ | 0,2 | _ |
Реакционную смесь тщательно перемешивают и инкубируют не менее 10 мин при комнатной температуре (20-25°С) или 5 мин при 37°С и измеряют оптическую плотность опытных и калибровочных проб против контрольной пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 5 см (1 см.) при длине волны 500 нм (ФЭК- 490 нм). Окраска стабильна не менее 2-х часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света.
Расчет концентрации (С) холестерина HDL проводят по формуле:
С = Ео/Ест * 1,29 (ммоль/л) или С = Ео/Ест * 50 (мг/100 мл) Ео и Ест – экстинция образца и стандарта, измеряется относительно контрольной пробы.
2.3.6. Определение ХС-ЛОНП (холестерина-липопротеидов очень низкой плотности) расчетным методом
Уровень ХС-ЛОНП находят путем деления показателя концентрации триацилглицеринов на 2,2 (ТГ/2,2). Вывод этой формулы расчетов базируется на том, что, во-первых, при отсутствии в крови хиломикронов (а они после 12-часового голодания у большинства пациентов не выявляются) практически все количество ТГ крови сосредоточено в ЛОНП и ,во-вторых, при не слишком высокой концентрации в крови (когда содержание ТГ не привышает 4,4 ммоль/л) в частицах ЛОНП на 22 молекулы ТГ приходится 10 молекул холестерола [12].
2.3.7. Определение ХС-ЛНП (холестерина липопротеидов низкой плотности) расчетным методом
Зная уровень ХСобщ плазмы, ХС-ЛВП и ХС-ЛОНП, нетрудно определить содержание ХС-ЛНП по формуле [12]:
ХС-ЛНП = ХС - (ХС-ЛВП + ХС-ЛОНП)
2.3.8. Определение индекса атерогенности (ИА) расчетным методом
Расчет индекса атерогенности призводят по формуле:
ХСпл – £-ХС /£-ХС Х (ЭХС/СХС)
ХСпл – общий холестерол плазмы
£-ХС (альфа-ХС) – холестерол супернатанта (ЛПВП)
ЭХС/СХС – отношение содержания эфиросвязанного и свободного холестерола супернатанта плазмы [12] .
2.3.9. Определение содержания диеновых коньюгатов(ДК) в эритроцитах
За основу взят классический метод Placer в модификации Гаврилова В. Б. [9] для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают в пробирках с притертой крышкой с 4 мл чистоперегнанных растворов изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают постоянно не менее одного часа затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через 1-2 часа отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232нм против контрольной пробы (Афон) где вместо гемолизата взято 0,5 мл H2O. Коэффициент экстинции при 233 нм –
2,2 * 10 -5 см-1 М-1. Формула для расчета: С(нмоль/мл эр)= (Аоп - Афон) * 36,4
2.3.10. Определение содержания ДК в плазме крови и гомогенате печени
За основу взят классический метод Гаврилова В.Б. и соавт [9], Владимирова Ю.А. и соавт. [7]. 0,4 мл плазмы вносят в пробирку с плотной крышкой и добавляют 4 мл чисто перегнанной смеси изопропанол : гептан (1:1). Смесь встряхивают в течение 20-30 мин затем добавляют 1 мл HCl (pH=2) после чего еще раз встряхивают две минуты, добавляют 2 мл чисто перегнанного гептана и снова встряхивают 10-15 мин. Примерно через час отбирают верхнюю фазу и фотометрируют при 232 нм против контрольной пробы где вместо гемолизата взято 0,2 мл H2O. Коэффициент экстинции 2,2 * 10 -5 см-1 М-1. Формула для расчета (при l=1 см):
С(нмоль/мл пл) = [(∆А* 106)/(2,2*105*1)]*[4/Vпроб], где: ∆А = Аоп - Афон, 2,2*105 – коэффициент экстинции, 1 (см) = L (толщина кюветы), 2 (мл) = Vгепт (объем гептана)
2.3.11. Определение содержания малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах
За основу взят классический метод Ernster et al [25] в модификации для эритроцитов. 0,5 мл гемолизата эритроцитов (1:1) смешивают с 1 мл охлажденной 5% ТХУ и тщательно растирают смесь стеклянной палочкой. После выдерживают при 0±5 °С не менее 1-2 часов смесь центрифугируют при 4000 g 30 мин. Далее тщательно отбирают 0,4мл надосадка в пробирки для кипячения и добавляют 1,0 мл 0,5% тиобарбитуровой кислоты. Смесь инкубируют в кипящей воде более 10 мин после чего охлаждают и фотометрируют при 532 нм против соответствующего контроля. В расчет принимают коэффициент молярной экститнции – 1,56*105 см-1 М-1. С(нмоль/мл эр) = ∆А * 115,8