Все это позволяет охарактеризовать катионные пептиды и белки клеток и жидких сред организма человека и животных как физиологически активные вещества многонаправленного действия. С их функционированием связаны такие защитно-приспособительные процессы, как фагоцитоз, воспаление и, возможно, стресс-реакция, причем в этих процессах они выступают не только в роли высокоэффективных антибиотических агентов. Им свойствен широкий функциональный потенциал, который реализуется в различных проявлениях клеточно-гуморальной кооперации в кровеносной и лимфоидной системах, соединительной ткани, пограничных эпителиях. Такая кооперация направлена на реализацию и регуляцию механизмов неспецифической резистентности макроорганизма к инфекции.
Есть все основания считать, что антимикробные белки и пептиды клеток и жидких сред организма являются особым классом физиологически активных веществ, отобранных в процессе эволюции в качестве биохимического механизма его барьерных систем и антимикробной защиты. Высокая концентрация катионных белков в клетках, осуществляющих защитные реакции, является веским тому доказательством. В частности, в 109 клеток нейтрофилов человека содержится 3.9±0.9 мг миелопероксидазы, 1.2±0.2 — катепсина G, 2.7±0.6 — эластазы, 4.3±1.2 —лактоферрина и 7.2 мг лизоцима. Поэтому функциональная неполноценность нейтрофилов, обусловленная наследственно детерминируемыми дефицитами или отсутствием в них отдельных представителей группы антимикробных катионных белков и пептидов, представляет редко встречающееся явление. Гораздо чаще в клинической практике имеют место случаи развития аутоинфекционных заболеваний и гнойных осложнений у больных хирургических, пульмонологических, педиатрических клиник, ожоговых центров и отделений реанимации, которые сопряжены с приобретенными дефицитами содержания этих белков. В дополнение к этому общеизвестны факты низкого уровня сопротивляемости организма новорожденных инфекциям и вследствие этого склонность к септическому течению заболеваний у детей в ранний постнатальный период онтогенеза. По мнению этих авторов, недостаточность хемотаксиса нейтрофилов и незавершенный характер фагоцитоза, осуществляемого ими, являются одними из ведущих причин сниженной резистентности новорожденных к инфекции. В то же самое время некоторые конкретные механизмы полома фагоцитоза в данных условиях остаются невыясненными. Это побудило нас провести комплексное морфобиохимическое и функциональное исследование с целью определения роли катионных белков и пептидов в обеспечении фагоцитарной функции нейтрофилов человека и некоторых лабораторных животных в ранний постнатальный период их развития.
Результаты сравнительного биохимического определения общего кислоторастворимого белка, миелопероксидазы, эластазы и катепсина G в нейтрофилах пуповинной крови новорожденных и взрослых доноров однозначно свидетельствуют о дефиците этих соединений в клетках детей. Параллельная оценка содержания гранулярных катионных белков и пептидов с использованием лизосомально-катионного теста соответствует данным этого анализа.
Подобная же закономерность изменения содержания катионных белков в нейтрофилах от первых дней рождения до периода половозрелости установлена нами при обследовании белых беспородных крыс и кроликов породы «Шиншилла». Необходимо отметить, что дефициту гранулярных катионных белков нейтрофилов кролика соответствовали низкие значения такого важного функционального показателя их активности, как завершенность фагоцитоза. Последнее обстоятельство является, по-видимому, одной из возможных причин генерализации листериозного и герпетического инфекционных процессов у животных 7-дневного возраста, которые у половозрелых особей протекают локально благодаря полной инактивации микроорганизмов в фагоцитах очага повреждения.
Сведения подобного рода были ранее получены только для миелопероксидазы крыс и лактоферрина нейтрофилов человека.
Таким образом, нами установлен временный дефицит антимикробных белков и пептидов нейтрофилов в период раннего постнатального развития человека и животных, который может составлять причину функциональной неполноценности фагоцитов и быть расценен как один из факторов риска развития аутоинфекционных заболеваний и септических осложнений. В дополнение к этому впервые получены строгие доказательства объективности данных цитохимического определения содержания катионных белков и пептидов нейтрофилов при использовании лизосомально-катионного теста.
Биологическая значимость антибиотических пептидов и белков однозначно просматривается в анализе явления резорбтивной клеточной резистентности.
Гипотеза о резорбтивной клеточной резистентности как особой форме антимикробной защиты организма человека и животных была выдвинута проф. В.Е. Пигаревским на основании результатов работ по исследованию морфодинамики воспалительных очагов повреждения при инфекционной патологии. Морфологический анализ инфицированных органов и тканей при хламидиальной и псевдотуберкулезной инфекциях показал, что макрофаги воспалительных очагов в процессе своей жизнедеятельности проходят стадию поглощения продуктов распада нейтрофилов, благодаря чему они становятся резистентными к микробному паразитированию. Опыты по инактивации этих возбудителей invitro ядерными гистонами и гранулярными катионными белками нейтрофилов частично свидетельствовали в пользу выдвинутой концепции.
С целью дальнейшего обоснования биологической значимости рассматриваемого явления и расшифровки его конкретных морфобиохимических механизмов нами было проведено комплексное исследование с использованием в качестве основного объекта изучения перитонеальных макрофагов кролика, выделенных из очага асептического воспаления на разных сроках после его индукции. Такое воспаление характеризуется надежно воспроизводимой во времени динамикой смены лейкоцитарных популяций. В первые 4—8 ч после введения в брюшную полость индуцирующего раствора крахмала наблюдается интенсивный выход туда нейтрофилов из крови. До 36 ч этот тип клеток является преобладающим в экссудате. В дальнейшем происходит закономерная смена клеточных популяций в очаге воспаления и к 48 ч макрофаги составляют уже не менее 90% клеток экссудата, причем около 50% из них содержат морфологически идентифицируемые остатки ядер и гранул нейтрофилов. В последующие 3 сут наблюдается постепенное исчезновение компонентов нейтрофилов из макрофагов в результате их переваривания в гранулярном аппарате последних. Подобная динамика клеточных реакций в очаге воспаления позволяет получать макрофаги с различным содержанием резорбированных антимикробных белков нейтрофилов и использовать их в витральных тест-системах.
В первой серии экспериментов изучали соотношение функциональной активности и количества миелопероксидазы гранулоцитарного происхождения в перитонеальных макрофагах кролика, выделенных из организма на разных сроках развертывания асептического воспаления. Установлена четкая положительная коррелятивная связь между показателями функциональной активности макрофагов и содержанием в них миелопероксидазы, которое максимально в 2-суточных клетках. Можно допустить, что именно с увеличением количества антимикробных белков нейтрофилов в вакуолярном аппарате макрофагов связано повышение их цитоцидного потенциала по сравнению с исходными интактными клетками. Подобный эффект наблюдали зарубежные исследователи при добавлении миелопероксидазы в инкубационную среду культуры макрофагов с фагоцитированными простейшими. Такой подход к анализу процесса резорбтивной клеточной резистентности позволяет более
Показатели функциональной активности и содержания антимикробных белков макрофагов
| Объект исследования | Содержание мне-лопероксядаэы, мг/10* клеток | Фагоцитарна* активность клеток в отношении Staphylococcusepidermidis | Процент НСТ-нозктивных клеток | |
| ФЧ.% | ФИ | |||
| Нейтрофилы | 0.565 | — | — | — |
| Перитонеальные | ||||
| макрофаги: | ||||
| резидентные | 0.03 | 25.0±1.3 | 3.2Ю.11 | 10.0Ю.8 |
| 2-суточные | 0.28 | 49.011.0* | 4.1±0.12*** | 31.011.1* |
| 3-суточные | 0.231 | 34.0±1.1** | 4.0Ю.09*** | 24.011.2* |
| 4-суточные | 0.15 | 30.011.2*** | 3.2±0.11 | 19.011.3** |
| 5- суточные | 0.05 | 28.0±1.3 | 2.310.15 | 14.011.1*** |
строго оценивать значение отдельных фракций катионных белков нейтрофилов в модуляции фагоцитарной активности макрофагов.
Нами было изучено влияние лактоферрина и дефенсинов кролика, исходно отсутствующих в резидентных перитонеальных макрофагах, на фагоцитоз последними стафилококков invitro. Установлено дозозависимое стимулирующее функциональную активность макрофагов действие испытанных белков. При этом выявлено, что лактоферрин имеет большее влияние на поглотительную способность клеток, тогда как дефенсины в концентрации 50 мкг/мл активнее стимулировали дыхательную функцию макрофагов. Первое может найти частичное объяснение в рамках представления об опсонизирующих свойствах лактоферрина, имеющего рецепторы на некоторых типах макрофагов.
Таким образом, совокупность приведенных экспериментальных данных свидетельствует в пользу выдвинутой В.Е. Пигаревским гипотезы о резорбтивной клеточной резистентности как об одном из механизмов осуществления неспецифических защитных реакций в организме человека и животных. Ряд зарубежных исследователей также установили сходные воздействия со стороны катионных белков нейтрофилов на функции макрофагов, Из этого следует, что эстафетная передача катионных пептидов и белков от нейтрофилов к макрофагам может рассматриваться в качестве одного из биохимических механизмов межклеточной кооперации, направленных на обеспечение барьерных функций организма против инфекционных факторов в период, предшествующий развитию специфических иммунных реакций. При этом резорбированные катионные белки и пептиды нейтрофилов через модуляцию функциональной активности макрофагов могут участвовать в формировании уже и специфических защитных реакций организма. Отдельные сведения в этом направлении исследований получены как отечественными, так и зарубежными учеными. По их мнению, биологически активные соединения нейтрофилов могут играть важную роль в инициации каскада клеточно-гуморальных взаимодействий, направленных на формирование специфического иммунного ответа при инфекционной патологии.
Исследования последних лет продемонстрировали еще ряд возможных путей вовлечения антимикробных пептидов и белков в регуляцию защитных реакций организма. В частности, японскими исследователями было изучено влияние дефенсинов как одного из ведущих молекулярных факторов кислороднезависимой антимикробной системы нейтрофильных гранулоцитов на ряд функциональных свойств этих клеток, таких как адгезия, хемотаксис, поглощение объектов фагоцитоза, продукция супероксиданиона. Дефенсины морской свинки в концентрации 15 нг/мл увеличивают экспрессию CDUb, CDllc и CD54 на поверхности нейтрофильных гранулоцитов от 42.1±1.6 до 58.3±2.3% и адгезию НГ морской свинки и человека. Они ингибируют продукцию супероксидных анионов в процессе фагоцитоза комплемент-опсонизированных частиц зимозана, но не влияют.