Антигены (стр. 2 из 3)

Оба ароматических соединения имеют в параположении отрицательно заряженный заместитель. Заместители отличаются степенью своей нуклеофильности, которая у сульфогруппы ощутимо выше, чем у карбоксильной группы, что приводит к более выраженному смещению облака я-электронов ароматического кольца в направлении заместителя, представленного сульфогруппой в сравнении с карбоксильной группой. Это обстоятельство и различия в размере замещающей группы достаточны, очевидно, для того, чтобы каждое соединение реагировало только с направленным к нему антителом.

Вопрос о размере детерминантной группы конъюги-рованного антигена, вкладе в ее специфичность различных радикалов был изящно проанализирован П. Шехтером. В качестве антигена использовали конъюгаты белка с олиго-О-аланином. Реакцию между антителами к поли-О-аланину и тест-антигеном ингибировали с помощью различных по размеру олигопептидов из D- и L-аланнна. Как оказалось, ингибирующий эффект гаптенов нарастал от ди- к тетра-О-аланнну. Дальнейшее увеличение длины пептида не усиливало его ннгибирующих свойств. Тетра-Ь-аланин был совершенно не активен как ингибитор. Эти данные означают, во-первых, что антитела четко различают олигопептиды из право- и левовращающих аминокислот, не имеющие регулярной вторичной структуры. Во-вторых, очевидно, что активный центр антитела соответствует по размеру тетрапептиду.

Дальнейшие опыты показали, что вклад каждого остатка аланина в связывание тетрапептида антителом далеко не одинаков. Были синтезированы аналоги гаптена, в которых один из остатков аланина заменяли на глицин. В случае замены N-концевого аланина на глицин константа связывания такого гаптена по сравнению с тетрааланином уменьшалась в 100 раз. Напротив, замена С-концевого аналина на глицин почти не сказывалась на величине константы связывания. Поскольку пептиды присоединяли к белку-носителю через С-концевую группу, можно заключить, что решающий вклад в связывание гаптена антителом вносит наиболее удаленный от молекулы белка-носителя участок присоединенного к ней пептида: в рассматриваемом случае метильная группа N-концевого аланина. Такая группа в молекуле гаптена получила название иммунодоминантной.

Таблица 1. Исследование специфичности антител к поли-Ь-алани-ну с помощью тетрапептидов различного строения

Конъюгированные антигены оказались весьма полезными для изучения многих ключевых проблем клеточной иммунологии, вопросов регуляции иммунного ответа.

2. Белки и синтетические полипептиды

Изучение антигенной структуры белков осуществляют с помощью нескольких методов: 1) исследованием продуктов ограниченного протеолиза, 2) химической модификацией различных боковых аминокислотных остатков с последующим анализом антигенного строения образующегося продукта, 3) разрушением присущей данному белку вторичной и третичной структуры. Каждый из перечисленных методов имеет свои ограничения, в силу чего достаточно полная информация о строении детерминантных групп белков может быть получена лищь при сочетании ряда методов.

При расщеплении мономера флагеллина по остаткам метионина с помощью бромциана образуются 4 фрагмента, размер которых

приведен на рис. Фрагмент А, составляющий менее половины молекулы, имеет в своем составе все антигенные детерминанты этого белка, так как полностью ингибирует реакцию антител против нативного флагеллина с нерасщепленным флагеллином. Существенно, что указанный фрагмент в отличие от остальной части молекулы содержит относительно резистентные к действию пепсина и трипсина участки полипептидной цепи. Это согласуется с заключением, согласно которому резистентность к ферментативному гидролизу служит фактором, благоприятствующим проявлению антигенных свойств биополимера.

Фрагменты, образующиеся при расщеплении флагеллина бромцианом

У глобулярных белков с большим содержанием а-спиральных участков антигенные детерминанты располагаются в местах изгиба скрученной в спираль цепи. Так, в миоглобине кашалота детерминанты располагаются между остатками 15—29, 56—69, 70—76, 77—89, а также в С-концевой части молекулы. Эти данные были получены при анализе продуктов гидролиза миоглобина трипсином и химотрипсином.

Как и в молекуле миоглобине, у стафилококковой нуклеазы антигенные детерминанты расположены на поверхности молекулы преимущественно в тех участках, где между спирализованными отрезками пептидной цепи находятся неспиралнзованные участки.

При антигенном анализе продуктов протеолиза белков желательно использовать антисыворотки от нескольких животных, полученные в различные сроки после иммунизации. Так, в случае изучения антигенной структуры белка вируса табачной мозаики было установлено, что индивидуальные антисыворотки кроликов реагируют, как правило, с С-концевым декапептидом, но часть антисывороток содержит антитела против N-концевого дека-пептида. Антитела к С-концевому декапептиду от некоторых кроликов взаимодействуют с пептидом, от которого отщеплен С-концевой аргинин, в то время как антитела от других кроликов распознают детерминанту только при наличии С-концевиго аргинина. Для наглядности приводим структуру указанного пептида:

Полученные в ранние сроки после иммунизации антитела кролика против растворимого коллагена из кожи крыс реагируют с детерминантами в С-концевой части молекулы, а «поздние» антитела взаимодействуют также с N-концевым участком.

Строение молекулы миоглобина кашалота

При иммунизации кроликов лизоцимом из яиц кур антитела появляются впервые через 10 дней. Но только через 2—3 месяца накапливаются определимые их количества, реагирующие с пептидами, которые включают остатки с 1 по 20 и с 60 по 83, поперечно связанные дисульфидной связью с остатками 123—129.

Закономерен вопрос, нельзя ли избежать отмеченных выше трудностей антигенного анализа, отказавшись от традиционной техники получения антител в результате иммунизации и оперируя вместо этого моноклинальными антителами, полученными с помощью гибридомной техники. Очезидно, что для детального анализа антигенной структуры, например белков, необходимо использование большого числа индивидуальных клонов. Чтобы учесть генетические особенности иммунного ответа индивидуальных реципиентов, придется производить слияние с клетками плазмацитомы лимфоидных клеток от генетически неидентичных особей, отбор которых может быть лишь случайным. Тем самым степень неопределенности задачи не уменьшится.

Продолжив рассмотрение вопроса о строении детерминантных групп белков, проанализируем один из широко применявшихся для этих целей методов, связанных с химической модификацией боковых аминокислотных остатков в глобулярных белках. Такое воздействие оказывает влияние на их антигенные свойства. В результате модификации изменяется, как правило, конформация молекулы. Так, модификация с помощью ангидрида янтарной кислоты 32 и 57 аминогрупп в молекуле бычьего сывороточного альбумина уменьшает способность белка взаимодействовать с антителами на 8 и 65% соответственно. Измерение при этом объема молекулы модифицированного альбумина, оцененное по величине стоксовского радиуса, показало, что в первом случае он возрастает на 27%, а во втором — уже на 78%. Следовательно, увеличение степени гидратации модифицированного белка за счет роста его отрицательного заряда при определенной степени модификации несомненно связано со значительным изменением нативной конформации. Последнее выражается и в разрушении детерминантных групп. То, что это заключение справедливо и инактивация белка как антигена в описанном выше примере не обусловлена лишь замещением аминогрупп, подтверждается данными, полученными при антигенном анализе бычьего сывороточного альбумина, в молекуле которого было амидинировано 58 аминогрупп. При таком способе модификации заряд белковой молекулы не изменяется. Не изменяется при этом и гтоксовский радиус. Антигенная структура модифицированного таким способом белка также практически полностью сохраняется.

Убедительные свидетельства существования как в глобулярных, так и в фибриллярных белках антигенных детерминант, структура которых зависит от пространственной конформации молекулы, были получены при сравнении антигенных свойств нативных и денатурированных белков.

В случае восстановления внутрицепьевых дисульфидных связей в молекуле рибонуклеазы в присутствии концентрированной мочевины такой белок утрачивает, по данным физических методов исследования, нативную конформацию. Одновременно происходит разрушение его антигенных детерминант, поскольку денатурированный белок не реагирует с антителами против нативного белка. Однако восстановление двух из четырех дисуль-фидных связей в молекуле рибонуклеазы, выполненное в отсутствие денатурирующих агентов, не сказывается на антигенных свойствах фермента. Аналогичные данные были получены при изучении пепсина, папаина, иммуноглобулина G. Следовательно, сама по себе дисульфидная связь не определяет структуры антигенных детерминант, если при ее разрыве не разрушают стабилизирующих вторичную и третичную структуру нековалентных связей.

Не только третичная, но и четвертичная структура белков определяет их антигенное строение. Детерминанты, в образовании которых участвуют две или три полипептидные цепи, в том числе цепи различного строения, найдены, в частности, в молекуле гемоглобина, коллагена, иммуноглобулина G. При диссоциации молекулы белка на изолированные цепи такие детерминанты разрушаются. В случае спонтанной рекомбинации пептидных цепей с восстановлением активной конформации восстанавливается также структура антигенных детерминант, в образовании которых участвуют две или 'более цепей.