Асимметрия мембран (стр. 2 из 6)

Весьма остроумным является подход к определению топографии полипептида, основанный на методах молекулярной генетики. Он состоит во введении чужеродного эпитопа в аминокислотную последовательность мембранного белка с последующим использованием антител, специфичных к этому эпитопу.

Химическая модификация

Этот подход широко использовался для локализации белков или их отдельных участков на поверхности мембраны или в ее гидрофобной области. Белок вступает в реакцию с реагентом, который может действовать лишь на одной стороне ориентированной мембраны или в ее гидрофобной сердцевине. Реагент, предназначенный для идентификации белка на поверхности мембраны, должен быть сильно полярным; он не должен адсорбироваться на мембране или накапливаться внутри ее. Для локализации же той части белка, которая находится в контакте с углеводородными хвостами липидных молекул, следует использовать очень неполярные реагенты, которые концентрируются в гидрофобной области мембраны. Артефакты, возникающие при этом подходе, чаще всего бывают связаны с тем, что реагент модифицирует белок не только в том реакционном пространстве, для которого он был предназначен. Например, реагент, направленный на модификацию поверхности мембраны, может иметь достаточно неполярный характер, чтобы проникать через мембрану и получать доступ к белкам внутреннего компартмента. Химическая модификация может также привести к повреждению мембраны и сделать ее проницаемой для того реагента, который, как ожидается, должен быть непроникающим. В табл. 1 перечислены некоторые из химических реагентов, используемые для изучения топографии мембранных белков.

Модификацию белков на поверхности мембраны часто проводят с помощью фермента лактопероксидазы, которая катализирует иодирование доступных остатков тирозина или гистидина. Поскольку реакция между I" и Н₂О₂происходит в активном центре лактопероксидазы, последняя должна быть в высшей степени «векторной», т.е. локализованной только на одной стороне мембраны. Однако при определенных условиях в ходе реакции может образовываться Ь, который, проникая через мембрану, способен иодировать аминокислотные остатки на внутренней стороне мембраны. Это показывает, насколько важен строгий контроль условий протекания реакций для исключения артефактов.

Для поверхностной модификации часто используются и другие реагенты — соли диазония, которые реагируют с боковыми цепями остатков лизина, цистеина, тироксина и гистидина, а также фотоак-тивируемые реагенты, например NAP-таурин.

В табл. 1 перечислен также ряд неполярных фотоактивируемых реагентов, которые используются для избирательной модификации аминокислотных остатков белка, контактирующих с гидрофобной областью бислоя. Эти реагенты обычно добавляют к мембранному препарату, дают им возможность накопиться в бислое и затем подвергают их фотоактивации. Преимущество образующихся при этом нитренов и карбенов состоит в том, что их реакции намного менее специфичны по сравнению с реакциями других активных частиц, так что ковалентная модификация не ограничивается боковыми цепями каких-либо определенных аминокислот. Правда, нитрены проявляют избирательность по отношению к нуклеофилам. Использование карбенов предпочтительнее, поскольку они вступают в реакцию с более высоким выходом. Для получения информации о вторичной структуре трансмембранных участков полипептидной цепи путем определения тех остатков, которые контактируют с липидами, использовали реагент ТИД. Например, спираль С бак-

Таблица 1. Некоторые реагенты, применяемые для изучения топографии мембранных белков

териородопсина включает метку лишь с одной стороны; это согласуется с представлением о том, что данная спираль является трансмембранной, причем ее неполярная область обращена в липидную фазу.

Локализация специфических центров

Ценную информацию иногда можно получить, определяя положение специфических центров в ряде белков. Например, места присоединения сахарных остатков в гликопротеинах плазматической мембраны всегда находятся на ее наружной поверхности, так что выявление их в полипептидной цепи имеет и топологическую ценность. Столь же информативными могут быть и данные о локализации сайтов модификации белка, например сайтов фосфорилирования, если локализация модифицирующего фермента известна. Так, в белках плазматической мембраны фосфорилированные аминокислотные остатки находятся на цитоплазматической стороне. Аналогичным образом может оказаться полезной локализация специфических мест связывания. Например, были идентифицированы места связывания бактериофага с экспонированными на поверхности клетки участками белков ОтрА и LamBнаружной мембраны Е. coli; для этого использовались мутантные белки.

Генетические подходы

Возможность генетической модификации мембранных белков привела к созданию новых подходов к их топографическому анализу. Такие методы, по всей вероятности, будут применяться все шире, однако пока число удачных примеров не столь велико, чтобы судить об их надежности и универсальности. Так, в белок ОтрА методами генной инженерии были встроены в определенные места короткие пептиды, затем был проведен протеолиз и по его результатам определено, были ли участки, содержащие включенный пептид, экспонированы на поверхности клетки. Анализ мутантных вариантов позволил идентифицировать также места связывания фага и соответствующие эпитопы в белках, экспонированных на наружной стороне мембраны.

Ценные данные о топографии белков цитоплазматической мембраны Е. coliбыли получены и с помощью метода гибридизации белков. Гибридные белки можно сконструировать так, что их N-концевой участок будет представлен мембранным белком, а на С-конце будет находиться каталитический центр щелочной фосфатазы. Щелочная фосфатаза обычно локализуется в периплазматическом пространстве Е. coli, куда она транспортируется и где проявляет свою ферментативную активность. Синтез многих мембранных белков, по-видимому, осуществляется линейным образом, начиная с N-конца. Поэтому, если место сочленения, где начинается последовательность щелочной фосфатазы, локализовано на периплаз-матической стороне мембраны, то гибридный белок будет транспортироваться в периплазму и проявлять ферментативную активность. Если же место сочленения находится на цитоплазматической стороне, то щелочная фосфатаза в гибридном белке останется внутри клетки и будет проявлять низкую ферментативную активность. Следовательно, те места сочленения в гибридных белках, которые приводят к высокой активности щелочной фосфатазы, будут соответствовать наружным доменам мембранного белка.

1.2 ПРИМЕРЫ АНАЛИЗА ТОПОГРАФИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ

Один из наиболее ярких примеров детального топографического анализа мембранного белка — это изучение бактериородопсина. Как показывают данные по реконструкции изображения, бактерио-родопсин имеет семь трансмембранных сегментов, по-видимому представляющих собой а-спирали. Результаты протеолиза, химической модификации и связывания антител согласуются с этой моделью, хотя точные границы трансмембранных сегментов не установлены.

Еще один белок, для которого получены непротиворечивые топографические данные, — это бычий родопсин. В этом случае анализ первичной структуры тоже предполагает наличие семи трансмембранных а-спиралей с соединяющими их петлями. С такой моделью согласуются результаты изучения топографии с помощью антител и протеаз, а также данные о локализации мест фосфорилирования и присоединения углеводов. Обратите внимание, что хотя бактериородопсин и родопсин связывают одну и ту же простетическую группу — ретиналь — и, по-видимому, уложены в мембране одинаковым образом, никакой гомологии в их аминокислотной последовательности не наблюдается и выполняют они разные функции. Бактериородопсин является бактериальным светочувствительным протонным насосом, а родопсин — это зрительный пигмент, содержащийся в палочках сетчатки. Под действием света родопсин претерпевает светозависимые конформационные изменения, инициируя целый каскад событий, конечным результатом которых является зрительный сигнал.

Большое внимание было уделено анализу топографии еще одного трансмембранного белка — ацетилхолинового рецептора. Исходя из анализа первичной последовательности, было предложено несколько топографических моделей этого рецептора, адекватность которых проверялась с помощью иммунологических методов. Следует, однако, отметить, что полученные данные весьма противоречивы; это означает, что применение этих методов не всегда является оправданным.

В качестве последнего примера можно привести микросомный цитохром Ь$. Этот белок функционирует как переносчик электронов, участвуя в некоторых окислительно-восстановительных реакциях в эидоплазматическом ретикулуме. Цнтохром bs — это амфифильный белок, в котором гемсвязывающий каталитически активный домен соединяется с помощью десяти аминокислотных остатков с неполярным доменом — мембранным якорем. Эти два домена можно отделить друг от друга путем проте-олиза. Структуру гемсвязывающего фрагмента изучали методом рентгеноструктуриого анализа. Строение якорного пептида на С-конце белка неизвестно. Топографические исследования, проводившиеся в нескольких лабораториях, были направлены на выяснение одного простого вопроса: пересекает ли этот якорь бислой или он погружен в него только наполовину и, сделав петлю, идет обратно, так что его N- и С-концы оказываются по одну сторону мембраны? Несмотря на все усилия, окончательный ответ на этот вопрос пока не получен. В большинстве исследований использовался очищенный цитохромом bs, встроенный в фосфолипидные везикулы. Проблема состоит в том, что разные методики реконструкции дают разные кон-формации белковой молекулы. При «непрочном» связывании цито-хрома bsС-конец доступен для карбоксипептидазы Y и локализован на той же стороне, что и гемсвязывающий домен. Однако с помощью определенных методик можно получить «прочно» связанный домен, в котором С-конец недоступен для протеолиза, что, вероятно, отвечает топографической ориентации белка invivo. Корана и др. пытались решить этот вопрос, изучая модификацию двух форм этого белка с помощью фотоактивируемых аналогов фосфолипидов. Они пришли к выводу, что в «прочно» связанной форме белка мембранный якорь пронизывает бис-лой. Этот вывод, однако, не нашел полной поддержки. Другие подходы либо вообще не позволили сделать выбор в пользу той или иной модели, либо дали противоречивые результаты.