Биосенсоры: основы и приложения (стр. 2 из 6)

Для сравнения концентрацию уксусной кислоты в бродильной среде для производства глутаминовой кислоты определяли описанным микробным сенсором и методом газовой хроматографии. Наблюдается хорошее согласие результатов, полученных двумя методами: коэффициент корреляции равен 1,04 для 26 опытов. Выходной сигнал сенсора (0,29-0,25 мкА) был постоянен (с точностью до +10% от исходного значения) более трех недель, при этом было выполнено 1500 измерений. Теперь этот микробный сенсор выпускается в Японии серийно.

1.5 Сенсор спиртов

В бродильных производствах необходимо непрерывно определять концентрации метанола и этанола в культуральных средах. При использовании спиртов в качестве источника углерода для культивируемых микроорганизмов концентрация спиртов должна поддерживаться на оптимальном уровне, чтобы избежать ингибирования субстратом. Как известно, спирты утилизируются многими микроорганизмами, следовательно, такие микроорганизмы можно использовать для конструирования спиртового сенсора [5].

Этанольный сенсор включает иммобилизованные Trichosporon brassicae и кислородный электрод. Способ иммобилизации клеток и конструкция электрода такие же, как в глюкозном сенсоре.

Для измерений этим сенсором в стационарных условиях требуется много времени, поэтому был использован импульсный метод, обеспечивающий отклик в течение всего 6 мин. Линейная зависимость между уменьшением тока и концентрацией этанола наблюдается в диапазоне концентраций от 2 до 22,5 мг/л. Для пробы с концентрацией этанола 16,5 мг/л разностный токовый сигнал воспроизводим с относительной погрешностью 6%. Стандартное отклонение составило 0,5 мг/л при числе опытов, равном 40.

Сенсор не проявляет чувствительности ни к летучим соединениям, таким, как метанол, муравьиная, уксусная и пропионовая кислоты, ни к нелетучим веществам.

Микробный этанольный сенсор использовали в дрожжевых бродильных средах. Определение концентрации этанола в тех же пробах методом газовой хроматографии дало результаты, сравнимые с полученными при помощи микробного сенсора: коэффициент корреляции составил 0,98 при числе опытов более 20. В диапазоне концентраций этанола 5,5-22,3 мг/л выходной ток сенсора оставался постоянным более трех недель, в течение которых было проведено 2100 анализов. Сейчас этот сенсор выпускается в Японии серийно.

1.6 Цефалоспориновый сенсор

Антибиотики обычно определяют с помощью турбидиметрического или титриметрического микробиологического анализа, однако методики такого определения довольно сложны и непригодны для экспрессных анализов.

Известно, что Citrobac'ter freundii вырабатывает фермент цефалоспориназу, который катализирует реакцию цефалоспорина с выделением протона:

Цефалоспориназа, однако, очень неустойчива и не подходит для изготовления ферментного сенсора. В сенсоре, чувствительном к цефалоспорину, можно использовать целые клетки Citrobacter freundii, которые иммобилизуют в коллагеновой мембране, помещаемой затем в мембранный реактор.

На рис.2.8 показана система для непрерывного определения цефалоспоринов. Она включает реактор мембранного типа с прокладкой в середине. Измерения рН, обусловливаемые ферментативной реакцией, измеряли комбинированным стеклянным электродом и регистрировали с помощью самописца.

При введении в реактор растворов, содержащих различные количества цефалоспоринов, разность потенциалов на электродах постепенно увеличивалась, пока не достигала некоторого максимума. Минимальное время отклика системы зависело от скорости потока и активности иммобилизованных бактерий в коллагеновой мембране.

При скорости потока 2 мл/мин максимальная разность потенциалов достигалась через 10 мин.

Получена линейная зависимость между максимальной разностью потенциалов и логарифмом концентрации цефалоспорина. С помощью цефалоспоринового раствора определяли 7-фенилацетиламидодезацетоксиспорановую кислоту (7-фенилацетил-ADCA), цефалоридин, цефалотин и цефалоспорин С.

Стабильность микробного сенсора проверяли, анализируя раствор, содержащий 125 мкг/мл 7-фснилацетил-АОСА. Цефалоспорин определяли несколько раз в день, однако наблюдаемая разность потенциалов не менялась в течение недели.

Эту систему применяли также для определения цефалоспорина С в культуральной среде Cephalosporium acremonium. Результаты измерений сравнивали с данными, полученными методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. В случае микробного сенсора относительная погрешность составила 8%, следовательно, сенсор вполне пригоден для непрерывного определения цефалоспоринов в ферментационных средах.

1.7 Сенсор БПК

Биохимическое потребление кислорода (БПК) - один из часто используемых показателей загрязнения органическими веществами. Обычно определение БПК требует пятидневной инкубации, поэтому необходим экспрессный метод оценки БПК, дающий более воспроизводимые результаты.

Насыщенный кислородом фосфатный буферный раствор (0,01 М, рН 7) пропускали через проточную ячейку со скоростью 1 мл/мин. Когда измеряемый ток достигал стационарного значения, в ячейку вводили пробу со скоростью 0,2 мл/мин. Значение стационарного тока зависело от БПК анализируемого раствора. Затем ток постепенно возвращался к начальному уровню. Время отклика сенсора (время, требуемое для достижения стационарного тока) зависело от природы анализируемого раствора.

Линейная зависимость между разностью токов (начального и стационарного значений) и БПК, определяемого после пятидневной выдержки в стандартном растворе глюкозы и глутамината, наблюдалась до значения БПК 60 мг/л. Нижняя граница определяемых концентраций составляла 3 мг/л. При анализе раствора с БПК, равным 40 мг/л, ток воспроизводился с относительной погрешностью +6% (число опытов более 10).

Рассматриваемый микробный сенсор применяли для оценки пятидневного БПК необработанных сточных вод бродильного производства. Пятидневное БПК сточных вод определяли также методом JIS (метод, рекомендованный Japanese Industrial Standard Committee). Значения БПК, оцененные микробным сенсором и определенные методом JIS, хорошо коррелировали между собой. С помощью данного сенсора оценивали также БПК необработанных промышленных сточных вод различных типов. Найдено, что сигнал сенсора определяется соединениями, присутствующими в сточных водах.

2. Основные биосенсоры на основе растительных и животных тканей

Тканевые материалы растительного и животного происхождения успешно используют в качестве биокаталитических компонентов биосенсоров. Биокаталитические материалы этого класса просто создают естественное окружение для представляющего интерес фермента, в результате чего требуемая ферментативная активность заметно стабилизируется. Во многих случаях тканевые биосенсоры служат намного дольше, чем аналогичные биосенсоры с выделенными ферментами. Кроме того, тканевые материалы сохраняют достаточно высокую специфическую активность, необходимую для конструирования некоторых биосенсоров, тогда как выделенные ферменты в тех же условиях разрушаются. В большинстве случаев эти преимущества достигаются не в ущерб избирательности. Если же в тканевом материале протекают мешающие процессы, разрабатывают специальные меры по увеличению избирательности. В этой главе достоинства тканевых биосенсоров показаны на конкретных примерах. Рассмотрено также несколько биосенсоров на основе таких биокаталитических материалов, как фрагменты животных клеток. Наконец, впервые предложены возможные механизмы транспорта (вход, внутренний перенос и выход) субстрата и продуктов в иммобилизованных клетках ткани.

Исторически тканевые биосенсоры появились позже рассмотренных в предыдущих главах ферментных и микробных биосенсоров. Возможность использования цельного фрагмента ткани млекопитающих в качестве биокаталитического слоя впервые была продемонстрирована на примере аргининового сенсора. Тонкий слой бычьей печени и соответствующее количество фермента - уреазы совместно иммобилизовали на поверхности аммиачного газочувствительного датчика. На кончике сенсора протекали каталитические реакции.

Разработка этого первого сенсора на основе ткани печени быка открыла путь к созданию тканевых биосенсоров.

2.1 Биосенсор АМР

Тканевые материалы не только удлиняют срок службы биосенсора, но и обеспечивают большую концентрацию заданного биокатализатора. Примером может служить рассматриваемый в этом разделе биосенсор AMP с газоаммиачным датчиком. Ограниченная площадь поверхности датчика не позволяет иммобилизовать большие количества ферментного препарата. Поэтому если специфическая активность последнего невысока, то и аналитические характеристики сенсора будут неудовлетворительными. Эффект низкой концентрации фермента проявился, в частности, в случае ферментного АМР-электрода, описанного в работе. Используемый в этом сенсоре выделенный фермент обычно имеет низкую активность, что приводит к малой величине наклона градуировочных кривых и короткому сроку службы. Чувствительность и срок службы сенсора AMP можно значительно улучшить при помощи тонкого слоя мышечной ткани кролика. Повышение чувствительности биосенсора непосредственно связано с пятикратным увеличением активности биокатализатора на поверхности датчика.

Выделенный фермент иммобилизуют на поверхности датчика с помощью диацетилцеллюлозной мембраны. В тканевом биосенсоре тонкий слой мышечной ткани кролика удерживают на датчике найлоновой сеткой с отверстиями размером 37 мкм. Сенсоры обоих типов хранят при комнатной температуре в рабочем буферном растворе, содержащем 0,1 М ТрисНС1, 0,1 М КС1 и 0,02% азида натрия (рН 7,5). После сборки тканевый биосенсор следует выдерживать от 2 до 4 ч для удаления фонового аммиака.