Міжклітинний транспорт вірусів рослин здійснюється за допомогою одного або декількох вірусспецифічних транспортних білків (ТБ). Саме транспортні білки відіграють ключову роль у переносі вірусного генома усередині інфікованої клітини до плазмодесм, далі в поширенні вірусної інфекції через плазмодесми по клітинах паренхіми і, у випадку деяких вірусів, у транспорті вірусного генома по судинах флоеми. Очевидно, що прогрес у дослідженні вірусних ТБ, їх взаємодій з вірусними нуклеїновими кислотами і різними вірусними і клітинними білками відкриває широкі перспективи для створення нових методів боротьби з вірусними інфекціями рослин.
Х-вірус картоплі (ХВК) є одним з розповсюджених патогенів картоплі в усіх зонах вирощування культури. На Поліссі України спричинювані ним втрати врожаю становлять в середньому 40,8 % [1]. ХВК превалює у посівах в моноінфекції чи в комплексі з іншими мозаїчними вірусами (64 % обстежених зразків) при ступені ураженості сортозразка 5-100% [2]. Контроль насіннєвого матеріалу показує, що у відкритий грунт висаджується здоровий пробірковий матеріал, який у процесі подальшого розмноження зазнає реінфекції: ураженість клонового матеріалу становить 13-57 % залежно від імунологічних характеристик сорту, досягаючи 100 % на окремих сортах.
При аналізі відібраного в полі матеріалу виявляється латентна інфекція в 20-70 % зразків, що вказує на необхідність використання імунологічних методів діагностики вірусу для отримання об'єктивної інформації щодо якості матеріалу в насінницькій, селекційній роботі, ефективності захисних заходів, при вивченні циркуляції вірусу в природних умовах. Біологічні особливості ХВК дають можливість виявляти його у вегетуючих рослинах методом крапельної аглютинації [3] при чутливості методу 1-100 мкг/мл, а також методом імуноферментного аналізу.
Контроль фітопатогенних вірусів потребує методичного забезпечення. Пошук нових методичних підходів при розробці і виробництві засобів діагностики з урахуванням особливостей патогенів спрямований на створення ефективних діагностикумів фітопатогенних вірусів.У представленій роботі ми ставили за мету розробити метод отримання чистих препаратів ХВК для виробництва діагностичної антисироватки.
ХВК накопичували на рослинах томатів сорту Перемога, які вирощували в умовах вегетаційної камери при 20 °С і фотоперіоді 16 годин. Заражали рослини в фазі 3-4 справжніх листків методом механічної інокуляції з попереднім опудрюванням карборундом. Строк максимальної концентрації вірусу в рослинах томату — 21-25 днів після інокуляції.
При розробці методу очищення використовували відомі методики [5-8] та прилад для препаративного електрофорезу [9,10], сконструйований в нашому інституті.
Контроль етапів отримання чистих препаратів проводили з використанням реакції крапельної аглютинації [3] та електронної мікроскопії нативних препаратів, контрастованих 2%-ним розчином фосфорно-вольфрамової кислоти, рН 6,0. Досліджували препарати за допомогою елек-троного мікроскопа Tesla-540 при інструментальному збільшенні 22-30 тис.
Спектри поглинання УФ-світла препаратами МВК реєстрували на однопроменевому спектрофотометрі СФ-46.
Для виділення препарату ХВК листя томатів відбирали на 21-25-й день після зараження.
Проводили інфільтрацію в 0,3 М трис-гліциновому буферному розчині, рН 8,3 з додаванням 0,1 %-ного 2-меркаптоетанолу (ME) та 0,01 М ЕДТА протягом 12 годин за температури +4 °С.
Попередня інфільтрація рослинного матеріалу сприяла підвищенню ефективності екстракції вірусу, блокуючи дію ферментів рослинного соку.
Після інфільтрації листя подрібнювали на вальцевому пресі ПВЛ-1 в присутності 0,3 М трис-гліцинового буфера, рН 8,3 у співвідношенні 1:2. Отриманий гомогенат віджимали через капронове сито. Екстракт в трис-гліциновому буферному розчині містив менше пігменту, ніж при використанні фосфатного чи цитратного буферних розчинів, що значно поліпшувало наступні етапи очистки.
Освітлювали екстракт шляхом центрифугування за 15 000 об/хв протягом 20 хв. До надосадової рідини додавали краплями 20 %-ний розчин тритон Х-100 до кінцевої концентрації 0,5% та інкубували 30 хв., не застосовуючи на цьому етапі органічних розчинників, які різко знижують вихід вірусу [11, 12]. Додавання тритон-Х 100 зумовлює розчинення клітинних мембран і хлоропластів перед осадженням поліетиленгликолем (ТТЕГ).
Первинне концентрування вірусу проводили шляхом додавання до екстракту 20 %-ного розчину поліетиленгліколю (м.в. 40000) та NaCl до кінцевої концентрації 8 % та 1,5 %, відповідно. Витримували 1 годину при температурі +4 °С. Преципітат відділяли центрифугуванням за 6000 об/хв протягом 20 хв.
Після центрифугування при 6000 об/хв в надосадковій рідині вірус серологічно не виявлявся. Для повної екстракції вірусу необхідно було проводити декілька послідовних ресуспендувань осаду 0,01 М трис-гліциновим буфером, рН 8,3, кожен раз освітлюючи екстракт низькошвидкісним центрифугуванням. На цьому етапі загальний об'єм отриманого препарату вірусу не перевищував 1/10 від початкового об'єму рослинного екстракту.
Після осадження ПЕГ екстракція ХВК із преципітата, який містить значну кількість білків рослини-хазяїна, ускладнена. Це потребує застосування ряду циклів екстракції вірусу із осадів та контролю на кожному етапі для уникнення значної втрати вірусу. Екстракція МВК з осадів проходить більш ефективно, якщо для гомогенізації рослинної тканини використовувати трис-гліциновий буфер, а не фосфатний чи цитратний. При використанні трис-гліцинового буфера основна кількість вірусу екстрагується при перших двох етапах ресуспендування.
Остаточне очищення препарату ХВК здійснювали за допомогою приладу для препаративного електрофорезу із застосуванням 40%-ної сахарозної подушки.
При проведені препаративного електрофорезу ХВК необхідно було підібрати оптимальні умови для очищення вірусу: рН та іонну силу буферних розчинів, температурний режим, напругу електричного поля, тривалість, концентрацію сахарозної подушки, кількість антигену; який можна розділити [12].
Сконцентрований осадженням ПЕГ препарат вірусу нашаровували на 40%-у сахарозну подушку висотою 10 см та діаметром 1,5 см, яка була сформована в електрофоретичній колонці.
Електрофорез вели в лужній системі буферів за температури 16-20 °С, сили струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в протягом 3 годин.
При відпрацюванні цього етапу отримання препарату МВК виявили, що електрофорез в 40 % сахарозі є ефективним прийомом дляконцентрування ХВК та очищення його від рослинних компонентів.
В роботі ми використовували 0.01М трис-гліциновий буфер, рН 8,3, який найбільше підходить як для екстракції ХВК, так і для електрофорезу. Виходили з того, що буферний розчин, який використовується при електрофорезі, повинен мати низьку іонну силу (0,005-0,02), що дозволяє застосовувати високі градієнти напруги вздовж колонки при мінімальному утворенні тепла. Крім того, мають бути підібрані такі значення рН буферних розчинів, щоб різниця в зарядах між компонентами суміші, яка розділяється, була максимальною [7, 12].
Напругу поля належить підтримувати настільки високою, наскільки можливо за умов мінімального утворення та розсіювання тепла. При розробці нашого методу мінімальний нагрів і конвекцію спостерігали при силі струму 8-10 мА та напрузі 380-400 в.
Важливим фактором при препаративному електрофорезі в 40%-ній сахарозі є температура: якщо охолодження недостатнє, то це призводить до нерівномірного розподілу фракцій.
Експериментальним шляхом визначали тривалість електрофорезу препарату ХВК. Після 1; 2; 3 годин електрофорезу зразки проби та сахарозної подушки перевіряли методами серології та електронної мікроскопії на наявність антигену. Встановлено, що після трьох годин електрофорезу вірус повністю осідав на поверхні пробки ПААГ.
Візуальне спостереження за перебігом електрофорезу показало, що через 30 хвилин після включення струму від зони проби починають відділятися пластівчасті утворення, які осідають на пробці ПААГ, формуючи ледве помітний шар. Вірогідно, це є агрегати ХВК, які утворилися після осадження ПЕГ і можуть містити залишки клітинного дебрису. При застосуванні диференційного центрифугування сконцентрованого ПЕГ препарату віруси, які перебувають в агрегованому стані, неминуче втрачаються [5], внаслідок чого знижується загальний вихід вірусу. За розробленою нами методикою, агрегати ХВК зберігаються саме завдяки відсутності проміжних циклів диференційного центрифугування.
Електрофоретична рухомість агрегатів у 40 %-ній сахарозі за створених нами умов є вищою за рухомість одиничних часток вірусу; можливо, швидкість міграції агрегатів вірусу збільшується за рахунок сили тяжіння.
Після проходження сахарозної подушки частки вірусу та агрегати утворюють шар на поверхні пробки 10 %-ного ПААГ, яка непроникна для ХВК. Тому, залишаючись на поверхні гелю, антиген додатково піддається електродіалізу, завдяки чому відокремлюються низькомолекулярні домішки рослинного походження. Крім того, під час електродіалізу збільшується розчинність агрегатів вірусу. ХВК переходить у фізрозчин у вигляді препарату достатньо високого ступеня чистоти.
Після закінчення електрофорезу препарат вірусу змивали фізіологічним розчином з поверхні пробки 10%-ного поліакріламідного гелю, яка відділяє робочий об'єм від нижнього електродного буфера. Верхній шар гелевої пробки діставали з електрофоретичної колонки, розтирали у фізрозчині, витримували 12 годин при температурі 4 °С та центрифугували із швидкістю 15000 об/хв. Надосадову рідину аналізували на присутність вірусу, об'єднували із змивом з поверхні ПААГ. Отриманий препарат використовували для проведення електронномікроскопічних та спектрофотометричних досліджень та як антиген для імунізації кролів.