Влияние гипотермии на содержание белков в тканях растений
1. Влияние гипотермии на содержание водорастворимых белков в тканях высших растений
Предположение о том, что во время закаливания растений к холоду происходит синтез белков, было впервые высказано Дж. Дойлом и П. Клинчем в 1927 году. Первые доказательства того, что процесс синтеза белка непосредственно участвует в закаливании растения, были получены Г. Симинович. Впоследствии во многих работах сообщалось об изменении содержания нуклеиновых кислот и общего белка во время закаливания растений к холоду. Анализ изменений водо- и солерастворимых белков озимой пшеницы после закаливания и перезимовки показал увеличение содержания водорастворимых белков. В то же время содержание солерастворимых белков снижалось. По этим признакам обнаружены различия между озимой пшеницей сорта Безостая 1 и высокозимостой мутантом этого сорта, полученным под действием нитрозометилмочевины. Аминокислотный анализ изучаемых белков выявил значительные изменения по этому признаку как у исходно формы, так и у мутанта под действием перезимовки. В ряде других работ сообщалось об изменении содержания общего белка во время действия низкой температуры и закаливания. При изучении биосинтеза белка во время низкотемпературно адаптации озимых злаков в связи с их морозостойкостью было установлено, что у озимой пшеницы, озимой ржи и ячменя при снижении температуры с 180С до 20С в первые – третьи сутки адаптации происходит снижение уровня синтеза белка, но на пятые – седьмые сутки синтез белка возрастает, при этом 10–15% обще массы растительного белка составляют вновь синтезированные белки, не присутствовавшие в контрольных растениях.
Во время перезимовки растений озимой пшеницы происходят значительные изменения в содержании белков в тканях корня и узлов кущения: наблюдается гидролиз белков в корнях и перемещение свободных аминокислот в узлы кущения, причем если осенью с понижением температуры количество растворимых белков в корнях уменьшается, то к весне оно увеличивается. Накопление белков за счет более слабого по сравнению с ростом замедления скорости белкового синтеза отмечалось в клетках корня кукурузы под влиянием пониженной температуры.
Применение электрофореза для разделения растительных белков позволило получить новую информацию о влиянии гипотермии на состав белков растений. Резкое снижение температуры вызывает заметные изменения в электрофоретическом спектре легкорастворимых белков. В частности, у озимой пшеницы в период перезимовки обнаружены значительные изменения в составе белков, выделенных из узлов кущения. В процессе закаливания образование белков, судя по количеству полос в электрофоретическом спектре, нарастало, а в осенне-зимний период уменьшалось. Была отмечена сортовая специфика в отношении этого признака. В частности, морозоустойчивый сорт озимой пшеницы отличался от морозочувствительного сорта большим числом полос в электрофоретическом спектре.
Появление новых полос в спектре белков под действием гипотермии и в процессе закаливания растений к холоду отмечается многими исследователями. В частности, в ходе процесса адаптации озимой пшеницы к низким отрицательным температурам отмечалось появление в электрофоретическом спектре белков с молекулярными массами 24 и 85 кДа, а также в дополнение к ним 67 и 74 кДа. При изучении полипептидного состава белков узла кущения озимой пшеницы в процессе зимовки было обнаружено изменение содержания глобулинов с молекулярными массами 23 и 48 кДа. Закаливание озимой пшеницы приводит и к изменениям в составе белков надземных органов, при этом наблюдается новообразование четко выраженных полос в электрофоретическом спектре в зонах высоко- и низкоподвижных белков. Авторы, учитывая, что значительная часть белков обладает ферментативными свойствами, предполагают появление ферментов, которые обнаруживаются только при холодовом воздействии на озимую пшеницу.
При исследовании белков, синтез которых коррелирует с возрастанием холодоустойчивости клеточных культур BromusinermisLeyss. cv. Manchar было отмечено усиление синтеза белков с молекулярными массами 25, 165, 190 и 200 кДа.
Одним из наиболее изученных к настоящему времени семейств белков, содержание которых в растении коррелирует с холодоустойчивостью, являются дегидрины. Данное семейство белков имеет определенные, характерные для этого семейства последовательности аминокислот, что позволяет достаточно легко и уверенно идентифицировать его членов как на уровне транскриптов, так и на уровне индивидуальных белков. В связи с этим члены данного семейства в настоящее время интенсивно изучаются.
Значительные изменения под действием холодовой акклиматизации были обнаружены при изучении экспрессии дегидринов у яровых и озимых зерновых культур. Было установлено, что содержание дегидриновых транскриптов возрастает с сентября по ноябрь, причем их содержание у яровых культур возрастает меньше, чем у озимых. При исследовании экспрессии гена дегидрина было обнаружено, что после 14 дне закаливания в контролируемых условиях в значительных количествах обнаруживаются три транскрипта, гибридизующихся с кДНК белка DHN-4. После низкотемпературно закалки растений в полевых условиях к ноябрю в растениях накапливался высоки уровень транскриптов дегидрина, при этом растения развивали очень высокую морозостойкость. Увеличение уровня синтеза дегидрина с молекулярной массой 50 кДа во время холодовой акклиматизации было отмечено у пшеницы. Было также установлено, что некоторые из полипептидов, появляющиеся под действием закаливания у других культур, также относятся к семейству белков-дегидринов.
С помощью электрофореза белков в градиенте ПААГ и изоэлектрофокусирования было показано, что закаленные и незакаленные к холоду листья озимой пшеницы имеют различающиеся белковые спектры. После закаливания наблюдалось появление белковых компонентов с высокомолекулярной массой. В ряде работ было высказано предположение, что холодовая обработка индуцирует синтез полипептидов с отличающейся первично структурой, поскольку этими авторами было установлено, что охлаждение проростков яровой пшеницы приводит к появлению новых полос не только в спектрах нативных белков, но и в электрофоретических спектрах белков, обработанных додецилсульфатом натрия.
Ф.Р. Гималов с соавторами констатировали, что под действием холодового шока у пшеницы происходит индукция синтеза полипептидов с молекулярными массами 50, 70 и 94 кДа. Впоследствии этими же авторами был проведен скрининг ряда представителей трибы Triticeaeдля сравнения полипептидов, синтезирующихся у них под действием гипотермии. Обработка объектов низкой температурой проводилась в течение 7 суток. Радиоактивная метка вводилась в течение последних 24 часов холодовой обработки. При помощи электрофореза в ПААГ и радиоавтографии было установлено, что у всех диплоидных видов понизился уровень синтеза полипептидов с молекулярной массой 50 и 66 кДа. У всех этих видов в спектре белков появился полипептид с молекулярно массо 43 кДа. В растениях вида T. urartuсинтезировались также белки с молекулярными массами 20, 27 и 37 кДа; у вида T. sinskajae– 20 и 37 кДа, а у T. monococcum– 20 и 27 кДа. У эгилопсов в спектрах появлялись белки с молекулярными массами 33 и 43 кДа и наблюдалось увеличение синтеза белков с молекулярными массами 20, 40, 50 и 62 кДа. У T. dicoccumнаблюдалось уменьшение синтеза белка с молекулярной массой 66 кДа и усиление синтеза белков с молекулярными массами 45 и 48 кДа. В белковом спектре появлялись полосы с молекулярными массами 20, 33 и 43 кДа. У T. aestivum наблюдалось появление в спектре белков с молекулярными массами 43 кДа и 43 и 48 кДа. Уменьшалось включение радиоактивно метки в белок 66 кДа и 46 кДа. У озимой ржи было отмечено снижение включения метки в белки с молекулярными массами 13, 38, 50 и 90 кДа и увеличение включения метки в белки с молекулярными массами 15 и 22 кДа. В белковом спектре появлялась полоса с молекулярной массой 28 кДа. Авторы выделяют ряд полипептидов, которые появляются в белковых спектрах большинства исследованных видов растений под действием пониженной температуры.
Из листьев закаленной к холоду капусты был выделен и очищен белок, который защищал тилакоиды незакаленного шпината от повреждения при замораживании. Процедура выделения включала в себя осаждение тепловой обработкой, осаждение сульфатом аммония и гликозаминогликаном гепарина, а также колоночную хроматографию на Полиамиде 6 и обращенно-фазную хроматографию на матриксе С-18. После обращенно-фазной хроматографии на электрофорезе была выявлена одна полоса с приблизительной молекулярной массой 7 кДа. Эта фракция имела криопротекторную активность. Гель-фильтрация подтвердила, что данный белок является мономером с молекулярной массой 7 кДа. Этот белок можно выделить только из закаленных к холоду растени капусты, но не из растени, выращенных в незакаливающих условиях. С использованием меченых пероксидазой лектинов было показано, что данный криопротектин является гликопротеином и содержит связанны остаток а1–3 связанной фукозы.
Листья омелы содержат тригалактозу и специфические N-ацетилгалактозаминные-изолектиновые группы. Группы ML I и ML III показали высокую криозащитную активность в изолированных мембранах тилакоидов шпината в период замерзания и оттаивания почвы, в то время как MLII не обладали такой активностью. В ходе экспериментов установлено, что криозащитная эффективность белков коррелировала с их относительно гидрофобностью. Было установлено также, что морозостойкость листьев омелы сезонно регулируется природными условиями. В то время как листья, собранные зимой, не повреждались при замерзании почвы до -200 C, листья, собранные в июле, претерпевали 70% утечку электролита после замерзания почвы до -50C. Данные экспериментов свидетельствуют, что и количество фракций ML I и ML III изменяется в течение года. Наиболее высокое содержание этих криозащитных лектинов наблюдалось зимой и ранней весной, а наиболее низкое – в период летних месяцев. Изменений в содержании ML II не было зафиксировано. Эти данные подтверждают то, что некоторые лектины могут играть роль в стабилизации клеточных мембран под действием стрессовых условий окружающей среды.