При изучении ответа лактозно-кислых бактерий на замораживание было установлено, что при замораживании культуры лактозно-кислых бактерий жизнеспособность клеток в значительно мере снижалась. В то же время, когда культуры бактерий перед замораживанием были предварительно подвергнуты в течение 2 часов холодовому шоку при 100C, значительно улучшалась жизнеспособность у штаммов Lactococcuslactissubsp.lactis и PediococcuspentosaceusPO2, но она не менялась у штамма Lactococcuslactissubsp. cremoris и у штаммов LactobacillushelveticusLB1 и StreptococcusthermophilusTS2. Жизнеспособность клеток возросла еще более, когда период холодового шока был продлен до 5 часов. Использование дегенерированных PCR пра меров, полученных как из гена важнейшего белка холодового шока Escherichiacoli, так и Bacillussubtilisприводит к образованию PCR продуктов у всех изученных штаммов. PCR продукт из Lactococcuslactisssp. LactisM474 был клонирован и секвенирован. Вычисленная для этого белка последовательность аминокислот показала высокую гомологию с аминокислотными последовательностями других белков семе ства CSP. Использование PCR праймеров, основанных на последовательность M474, приводило к образованию PCR продуктов только у изученных штаммов лактококков, но не у изученных штаммов Lactobacillushelveticus, Streptococcusthermophilusили Pediococcuspentosaceus.
9. Гены протеинкиназ
Клон кДНК для гена рецепторо-подобно протеинкиназы был выделен из Arabidopsisthaliana. Этот клон длиной 1952 bp с открытой рамкой считывания размером 1623 bp кодирует пептид из 540 аминокислот, которы содержит четыре области, характерных для рецепторной киназы. Во-первых, он содержит характерную для киназ предполагаемую аминотерминальную сигнальную область последовательности. Во-вторых, он содержит область с пятью экстрацеллюлярными богатыми ле цином повторяющимися последовательностями. В-третьих, он имеет мембрано-связывающую область и, в-четвертых, домен цитоплазматическо протеинкиназы, который содержит все 11 субдоменов, характерных для протеинкиназ. Ген RPK1 экспрессируется в цветах, побегах, листьях и корнях. Показано, что экспрессия гена RPK1 индуцируется в течение 1 часа после обработки экзогенно абсцизовой кислотой. Ген также быстро индуцируется различными другими абиотическими стрессами, такими, как обезвоживание, высокая концентрация солей и низкая температура. Предлагается, что данный ген вовлечен в общий ответ клетки на стресс. Вызванная обезвоживанием индукция гена rpk1 не нарушается в дефицитных по эндогенно абсцизовой кислоте мутантах aba-1, abi1-1, abi2-1, abi3-1 и, вследствие этого, предполагается, что эта индукция не зависит от обработки абсцизовой кислотой.
10. Гены картофеля, индуцируемые хранением на холоду
Хранение клубне картофеля на холоду при 4 0C связано с
накоплением нескольких индуцируемых холодом транскриптов генов. Путем использования в качестве зонда ранее охарактеризованной кДНК был выделен и секвенирован соответствующий ген ci7.
Предполагаемы промотор ci7 содержит последовательность элементов, которая, как было показано, регулирует экспрессию индуцируемых холодом генов у Arabidopsisthaliana. Транскрипты CI7 дифференциальной экспрессируются в клубнях и листьях картофеля в ответ на холодовой стресс, засуху, высокую концентрацию солей или обработку экзогенно абсцизовой кислотой. В то время как накопление транскриптов CI7 во время хранения на холоду происходит в течение нескольких дне, индукция транскриптов CI7 в ответ на засуху, экзогенную абсцизовую кислоту и солевой стресс происходит быстро, в течение нескольких часов. Накопление белка CI7 в ответ на абиотические стрессы и обработку экзогенно абсцизовой кислотой в клубнях было небольшим, особенно по сравнению с уровнем содержания транскриптов. В листьях белок CI7 отсутствовал после всех исследованных воздействи. В ходе экспериментов растения S. tuberosumбыли трансформированы слитым с репортерным GUS-геном 5'-фланкирующим промоторным регионом ci7 размером 3 kb. Анализ клубне независимых трансгенных лини не обнаружил значительно индукции энзиматической активности GUS в ответ на низкотемпературное воздействие. В то же время, когда для анализа уровня индукции гена GUS с введенным ci7 промотором был использован РНК блоттинг, гетерологичное слияние GUS сильно индуцировалось в ответ на низкие температуры. По сравнению с РНК блот-анализом трансгенных растений, изучение ядерной «run-on» транскрипции ci7 гена показало, что большая часть температурно-регулируемо экспрессии гена ci7 в клубнях может быть связана с посттрансляционными механизмами контроля.
Анализ последовательности кДНК клона CI21, который соответствует другому индуцируемому холодом транскрипту, обнаруживает высокую гомологию с транскриптами томата и дикого картофеля, индуцируемыми созреванием и водным стрессом. Два гомологичных, неаллельных гена, ci21A и ci21B, были выделены и секвенированы. Нозерн-блот анализ показал, что самые высокие уровни содержания транскриптов ci21 обнаружены в хранимых в холоде клубнях. Более низкие уровни транскриптов содержатся в стеблях и корнях, и самые низкие уровни отмечены в листьях и клубнях, хранимых при комнатной температуре. Обработка растений абсцизовой кислотой, высокая концентрация соли и тепловой шок не оказывали значительного влияния на уровни содержания транскрипта ci21 в клубнях и листьях. Подсушивание было единственным стрессом, вызывавшим транскрипцию CI21 на листьях, но оно не вызывало ее в клубнях. Вестерн-блот анализ обнаружил белок CI21 только в клубнях. Химерный ген, созданный путем слияния предполагаемо области промотора ci21A и репортер-геном uidA, тестировался на индукцию бета-глюкуронидазы низко температуро в трансгенных картофельных растениях, при этом в ответ на хранение клубне при 4 0C у трансгенных растений наблюдалось двукратное увеличение активности бета-глюкуронидазы.
11. Гены Y-box белков и белков, регулирующих процессы транскрипции и трансляции
В ходе исследований экспрессии генов семейства Y-бокс белков, регулирующих процессы транскрипции в клетках, было установлено, что высококонсервативный элемент основы промотора grp78 играет важную роль в индукции grp78 под разнообразными стрессовыми сигналами. Предшествующее изучение установило функциональную область в 3' конце основы промотора, которая проявляет стресс-индуцируемые изменения в стрессированных ядрах. В ходе экспериментов показано, что человечески фактор транскрипции YY1 связывает SICR и трансактиваторный элемент основы промотора в условиях стресса. Скрининг библиотек с данным элементом промотора выявил два новых связывающих эту область промотора белка, YB-1 и DBPA. Оба белка принадлежат к семейству Y-бокс белков, для которых характерен эволюционно- устойчивы ДНК-связывающий мотив - домен холодового шока. В ходе исследований в экспериментах по ко-переносу было установлено, что Y-бокс белки выступают в стрессированных клетках антагонистами WI-опосредованного управляемого grp78 усиления транскрипции. Таким образом, белки, имеющие домен холодового шока, могут быть частью механизма передачи сигнала стресса у млекопитающих.
В то же время проблематично существование особых факторов транскрипции для специфических функци в элементах промотора, особенно в таких системах, как G-бокс, поскольку существуют многочисленные синергические специфические для G-бокса факторы, в частности, промотора алкогольдегидрогеназы у Arabidopsis, которы регулирует экспрессию в ответ на холодовое возде ствие и обезвоживание.
12. Гены, связанные с низкотемпературной акклиматизацией
В ходе исследований по изучению влияния низкотемпературно акклиматизации на экспрессию генов в растениях выявлено и охарактеризовано значительное число генов, экспрессия которых индуцируется во время этого процесса как в травянистых, так и в древесных растениях. Значительное число этих генов индуцируется также экзогенно абсцизово кислото и засухо. В то же время выявлены гены, которые специфичны для процесса акклиматизации растения к низким температурам и не индуцируются другими типами абиотического стресса.
Для установления молекулярных основ холодово акклиматизации у клубники было проведено выявление генов, ассоциированных с низкотемпературно акклиматизацие.
Дифференциальный скрининг библиотеки кДНК, изготовленно из акклиматизированных к холоду растений клубники, позволил изолировать различные кДНК, дифференциально экспрессирующиеся при низкотемпературно акклиматизации. Нозерн-блот анализ показал, что уровень транскриптов Fcor1 возрастал после 2 дне низкотемпературно акклиматизации, в то время как аналогичны показатель Fcor2 увеличивался только после 2 недель низкотемпературно акклиматизации. С друго стороны, уровень содержания транскриптов Fcor3 снижался в течение 24 часов воздействия низкотемпературно акклиматизации и оставался на низком уровне в течение 8 недель периода акклиматизации. Гены Fcor1 и Fcor2 экспрессируются во всех тканях, в то время как ген Fcor3 специфичен для листьев. Кодируемы геном Fcor1 белок имеет высокое содержание ле цина, изолейцина, глицина, пролина и серина. Данный белок имеет гомологию с белками, кодируемыми геном ячменя blt101, индуцируемым низкотемпературно акклиматизацие, и геном Lophopyrumesi3, индуцируемым солевым стрессом. Белок FCOR2 богат лизином, лейцином, валином, аланином и аргинином и не имеет гомологии ни с каким из продуктов известных генов. Частичны клон кДНК Fcor3 кодирует полипептид, имеющий очень высокую идентичность с субъединице VPSI из шпината и с полипептидом PSIPsag из ячменя. Уровень накопления транскриптов Fcor1 коррелирует с устойчивостью к замораживанию у исследованных сортов клубники.
Клон кДНК pbn59 был изолирован путем дифференциального скрининга библиотеки кДНК акклиматизированного к холоду озимого рапса. Нуклеотидная последовательность BN59 оказалась гомологичной последовательности, кодирующей 70 кДа субъединицу вакуолярной Н+-АТФазы в растениях. Транскрипты, гибридизующиеся с BN59, аккумулируются во время воздействия низко температуры и воздействия экзогенно абсцизовой кислоты. Вестерн-блоттинг белков также показал увеличение содержания 70 кДа субъединицы во время акклиматизации к холоду. Накопление эндомембранной Н+-АТФазы следует также из наблюдений за осмотическим регулированием, увеличением содержания эндогенно абсцизово кислоты и пролиферации эндомембран в течение холодной акклиматизации.