Дейтерий - меченный l-фенилаланин, продуцируемый штаммом Brevibacterium methylicum для медицинской диагностики (стр. 2 из 3)
Таблица. Изотопный состав ростовых сред и биосинтетические характеристики B. methylicum
 Номер опыта | Компоненты среды, об.%H2O 2H2O Метанол [U-2H] Метанол | Лаг-период, ч | Выход микробной биомассы, % от контроля | Время генерации, ч | |||
| 1 | 98 | 0 | 2 | 0 | 20 | 100 | 2.2 |
| 2 | 98 | 0 | 0 | 2 | 30 | 92.3 | 2.4 |
| 3 | 73.5 | 24.5 | 2 | 0 | 32 | 90.6 | 2.4 |
| 4 | 73.5 | 24.5 | 0 | 2 | 34 | 85.9 | 2.6 |
| 5 | 49.0 | 49.0 | 2 | 0 | 40 | 70.1 | 3.0 |
| 6 | 49.0 | 49.0 | 0 | 2 | 44 | 60.5 | 3.2 |
| 7 | 24.5 | 73.5 | 2 | 0 | 45 | 56.4 | 3.5 |
| 8 | 24.5 | 73.5 | 0 | 2 | 49 | 47.2 | 3.8 |
| 9 | 0 | 98.0 | 2 | 0 | 58 | 32.9 | 4.4 |
| 10 | 0 | 98.0 | 0 | 2 | 60 | 30.1 | 4.9 |
| 10’ | 0 | 98.0 | 0 | 2 | 40 | 87.0 | 2.8 |
Кривые, отражающие динамики роста исходного и адаптированного к 2Н2О штамма B. methylicum и максимальному уровню накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости на минимальных средах с добавкой 2 об.% СН3ОН/С2Н3О2Н и 98 об.% 2Н2О представлены на рис. 2.
Выход биомассы, время клеточной генерации и максимальный уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости исходным мутантом (б) и мутантом, адаптированным к высокому содержанию дейтерия в среде (в) на средах, максимально насыщенных дейтерием, приведены в гистограмме относительно контрольного микроорганизма на протонированной среде (а). Сравнивали ростовые данные адаптированного к дейтерию микроорганизма и секрецию L-фенилаланина (б) с исходным B. methylicum на протонированной среде М9 (а) и на полность дейтерированной среде (98 об.% 2Н2О) с 2 об.% С2Н3О2Н (б). Как видно из представленных данных, в отсутствии дейтерий-меченных субстратов продолжительность лаг-фазы не превышала 24 ч (рис. 2, а). С увеличением концентрации 2Н2О в среде продолжительность лаг-фазы увеличивалась до 64,4 ч на средах с 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н (рис. 2, б). Отмечено, что длительность времени клеточной генерации с увеличением степени изотопного насыщения среды дейтерием постепенно увеличивается, достигая 4,9 часов на максимально дейтерированной среде (рис. 2, опыт б). Как видно из рис. 2, опыт б, С2Н3О2Н не вызывал существенного ингибирования роста и не оказывал влияния на выходе микробной биомассы, в то время как на средах с 98 об.% 2Н2О микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза по-сравнению с контролем. Важно то, что, выход микробной биомассы, время клеточной генерации и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к 2H2O штамма B. methylicum на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н изменяются незначительно (гист., опыт б).
Общей особенностью биосинтеза L-фенилаланина было значительное увеличение его продукции на ранней фазе экспоненциального роста B. methylicum, когда выход микробной биомассы был незначителен (рис. 3). Во всех экспериментах наблюдалось ингибирование биосинтеза фенилаланина на поздней фазе экспоненциального роста и снижение его концентрации в ростовых средах. Согласно данным по микроскопическому исследованию растущей популяции микроорганизмов, подобный характер динамики секреции фенилаланина не коррелировал с качественными изменениями ростовых характеристик культуры на различных стадиях роста, что служило подтверждением морфологической однородности микробной популяции. Мы предположили, что накопленный в процессе роста фенилаланин ингибировал ферменты собственного пути биосинтеза. Кроме того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза [21]. При обсуждении механизма биосинтеза L-фенилаланина следует отметить, что он синтезируется в клетках микроорганизмов из префеновой кислоты, которая через стадию образования фенилпирувата превращается в фенилаланин под действием клеточных трансаминаз [22] (схема 1). Данные тонкослойной хроматографии (ТСХ) и масс-спектрометрического анализа культуральной жидкости показали, что кроме L-фенилаланина данный штамм B. methylicum синтезирует и накапливает экзогенно другие аминокислоты: аланин, валин, лейцин, изолейцин.
Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопа 2Н в L-фенилаланин в составе культуральной жидкости определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метилового эфира дансил-фенилаланина или в виде Z-производного фенилаланина после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ.
Производные аминокислот при этом получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости дансилхлоридом (DnsCl) или карбобензоксихлоридом (Zcl). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1. Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана как этерифицирующего реагента был обусловлен необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих изотопный (1Н-2Н) обмен в ароматических аминокислотах.
В качестве примера на рисунке показана фрагментация метилового эфира дансилфенилаланина при электронном ударе. В масс-спектрах этого производного, как правило, четко детектируется пик молекулярного иона метилового эфира дансилфенилаланина М+. с m/z 412. Пик аминного фрагмента А имеет невысокую интенсивность, а пик аминоацильного фрагмента В крайне низкую или вообще отсутствует (см. рис. 1). Кроме вышеобозначенных пиков, в масс-спектрах электронного удара Dns-Phe-OMe фиксируются пики с массовым числом m/z 250, 234, 170, которые соответствуют дансильному фрагменту и продуктам его распада до N-диметиламинонафталина .
Масс-спектр фенилаланина, выделенный из культуральной жидкости, содержащей 98 об.% 2Н2О показан на рис. 4,б (спектр приведен относительно контрольных условий (а), где использовали обычную воду и метанол). Из рис.2,б видно, что величина пика молекулярного иона производного фенилаланина (М+. с m/z 418,0) увеличивается по сравнению с контрольными условиями (М+. с m/z 412,0) на 6 единиц, что составляет 75 % от общего количества атомов водорода в молекуле. Очевидно, что вышеобозначенные атомы дейтерия включились в молекулу фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы, так как маловероятно, что они заместились в в ходе выделения аминокислоты из культуральной жидкости или при химической модификации фенилаланина (протоны (дейтероны) при гетероатомах в NH2-, и -COOH группах фенилаланина за счёт лёгкости диссоциации не учитывались). Пик с m/z 432, зафиксированный в масс-спектре культуральной жидкости (рис.4,б) вероятнее всего соответствует продукту дополнительного метилирования фенилаланина по а-NH2- группе. В масс-спектре фиксируется пик обогащённого дейтерием бензильного фрагмента с m/z 97 (вместо 91 в контроле), что указывает на то, что местами локализации атомов дейтерия в молекуле фенилаланина являются положения С1-С6 ароматических атомов и сопредельное с ними положение при углеродном атоме b. Причем, как миниум четыре из них могут быть локализованы в самом бензольном кольце молекулы фенилаланина. Полученный результат по степени дейтерированности фенилаланина важен для его использования в медицинской диагностике, где необходимо применять соединения с высокими степенями изотопного обогащения.
Таким образом, в результате несложного селекционного подхода удалось получить штамм факультативных метилотрофных бактерий B. methylicum, адаптированный к высокому содержанию 2Н2О в ростовой среде. Преимуществами данного штамма для получения [2H6]-фенилаланина являются улучшенные ростовые и биосинтетические способности этого метилотрофа на максимально дейтерированной среде. За счёт использования штамма B. methylicum удалось получить около 1 грамма [2H6]-фенилаланина из 1 л культуральной жидкости (фенилаланин был также выделен из культуральной жидкости B. methylicum методом обращенно-фазовой ВЭЖХ в виде метилового эфира дансил-L-фенилаланина со степенью хроматографической чистоты 99 % и выходом 89 %). В заключение следует отметить, что более высокая эффективность мечения фенилаланина может быть обеспечена за счёт полной замены протонированных солей в составе ростовой среды на их дейтерированые аналоги, а также используя лейцин, униформно меченный дейтерием, который в принципе можно выделять из гидролизатов суммарных белков биомассы данного микроорганизма.
ЛИТЕРАТУРА.
1. Patel G.B., Sprott G.D., Ekiel I. // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - V. 59. - N. 4. - P. 1099-1103.