Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, выделенной в первой серии эксперимента, делаем посев на скошенный агар.
Подготовленные таким образом культуры инкубируем в термостате 24 ч при температуре (40±0,5)°С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводили 5 см 3 соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносим в колбы, содержащие по 50 см3 соответствующей синтетической среды. Культивирование микроорганизмов проводили в течение различного времени при температуре (40±0,5)°С при переменном механическом воздействии, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 250 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки.
2.2.7 Определение мутности
Мутность определяют фотометрическим способом на приборе КФК-2-УХЛ-4.2 при D2540 и толщине поглощаемого слоя 30 мм. Стандартным раствором является дистиллированная вода.
2.2.8 Высаливание фермента
В колбу отбирают 50 см3 бактериальной суспензии, добавляют 30% от ее массы сульфата аммония, перемешивают. Раствор и образующийся осадок переносят в патроны и устанавливают в центрифугу марки ЦЛН-2. Продолжительность вращения 15 мин со скоростью 5000 об/мин. После чего образовавшийся осадок собирают в бюкс.
2.2.9 Биуретовый метод по Ярош
Метод используется для определения раствора белков с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг/см3.
В пробирку наливают 2,4 см3 раствора мочевины, 0,1 см3 раствора белка и 2,5 см3 биуретового реактива. Смесь хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную баню или в термостат при 400С на 10 мин. Затем их охлаждают до 200С. Через 30 мин после добавления биуретового реактива раствор колометрируют при длине волны 540 нм. Количество белка находят по калибровочной кривой, составленной по яичному альбумину (рис. 1).
Для построения калибровочной кривой готовят исходные водные растворы с содержанием 15,20,25,30,35,40 и т.д. мг белка в 10 см3. Из полученных растворов отбирают в пробирки по 0,1 см3, добавляют 2,4 см3 раствора мочевины и 2,5 см3 биуретового раствора и ведут определений описанным выше методом.
2.2.10 Определение активности липазы (модифицированный метод Ота, Ямада)
За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и t=37°С в течение 1 ч.
Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливковое масло.
Для проведения этого анализа необходимы следующие реактивы: раствор оливкового масла (субстрат), 2%-ный раствор поливинилового спирта, 1н раствор соляной кислоты, 0,05н раствор щелочи, фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0, 1%-ный раствор фенолфталеина, 90%-ный раствор спирта, 1%-ный раствор фермента.
Приготовление субстрата. 100 см3 оливкового масла смешивают со 150 см3 2%-ного раствора поливинилового спирта в эмульсаторе. Полученную эмульсию выдерживают на льду в течение 60 мин. Если расслаивания не наблюдается, субстрат пригоден к использованию.
Приготовление раствора поливинилового спирта. 20г спирта помещают в мерную колбу на 1 дм3 и добавляют 800 см3 дистиллированной воды. Суспензию выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляют 0,5 см3 1н раствора соляной кислоты и непрерывно перемешивают при температуре 80–90°С в течение 1 ч. Затем раствор охлаждают, доводят до рН 7,0 раствором щелочи, объем доводят до 1 дм3 дистиллированной водой и полученный раствор фильтруют.
5 см3 эмульсии – субстрата и 4 см3 буфера с рН 7,0 помещают в колбу на 100 см3, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37°С в течение 10 мин. Затем к смеси добавляют 1 см3 раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37°С в течение 60 мин, после чего немедленно добавляют 30 см3 этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором щелочи в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до появления окраски.
Контрольную пробу готовят следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37°С добавляют 30 см3 этанола, затем 1 см3 ферментного раствора и смесь немедленно титруют.
Разность между результатами титрования контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора щелочи, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.
Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (1):
А ´Т
ЛС =– ´ 50, (1)
В
где ЛС – липазная активность фермента, ед/г;
А – разность между результатами титрования опытной и контрольной проб, см3;
Т – титр щелочи;
В-концентрация образца ферментного раствора, г/см3.
2.2.11 Определение протеолитической активности (метод Вильштеттера и Вальдшмидт – Лейтца в модификации)
Данный метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.
Протеолитическую активность выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-го раствора желатина с рН 7,3–7,5 1 см3 ферментного раствора за 1 ч при температуре 40°С. За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 см3 аминного азота за 1 ч в принятых условиях опыта.
Для проведения анализа необходимы реактивы: фосфатный буферный раствор с рН 7,3–7,5; 5%-ный раствор желатина (субстрат) – 5 г желатина предварительно замачивают в стеклянном стаканчике в 15–20 см3 дистиллированной воды в течение 20–30 мин. Набухший белок заливают 20–25 см3 буферного раствора температурой 70–80°С и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Растворившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см3 к не растворившейся части добавляют еще 20–25 см3 буферного раствора и снова переносят полученный раствор в эту же колбу. Так повторяют до полного растворения желатина. Охлажденный до 40°С раствор желатина доводят до метки буферным раствором такой же температуры.
Перед анализом раствор желатина нагревают до 40°С на водяной бане; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина – 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96% спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см3 и после растворения доводят до метки; 0,1 н раствор щелочи; 96%-ный этиловый спирт.
К 10 см3 5%-ного раствора желатина с рН 7,3–7,5 приливают 2 см3 испытуемого ферментного раствора и сразу не отбирают 1 см3 реакционной смеси в коническую колбу на 50–100 см3, куда предварительно налито 20 см3 96%-ного этилового спирта и 0,2 см3 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1 н раствором щелочи. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02 см3.
Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40°С для гидролиза. Через 3 ч 1 см3 реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбу на 50–100 см3, куда предварительно налито 20 см3 96%-ного этилового спирта и 0,2 см3 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.
Расчет протеолитической активности (ПС) ведут по формуле (2):
А
ПС = –, (2)
(t ´P)
где ПС – протеолитическая активность, ед/г;
А – количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;
t – время протеолиза, ч;
Р – коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см3 жидкого ферментного препарата.
Величина А рассчитывается по формуле (3):
А = (а – ак) ´1,4 ´К, (3)
где а – количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см3 раствора опытного, см3;
ак – количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см3 контрольной пробы, см3;
1,4 – коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;
К – поправка к титру щелочи.
2.2.12 Определение содержания СПАВ
Для определения содержания в сточной воде анионактивных СПАВ применяют фотометрический метод, основанный на том, что эти СПАВ образуют с метиленовым голубым комплексные ассоциаты, растворяющиеся в хлороформе с образованием синих растворов. Сам метиленовый голубой в хлороформе не растворяется.
Приготовление рабочего раствора: 10 см3 стандартного раствора разбавляют дистиллированной водой до 1 дм3.
Построение калибровочного графика: в ряд делительных воронок, содержащих 100 см3 дистиллированной воды, помещают 0; 0,5; 1,0; 2,0;…; 16,0; 20,0 см3 рабочего раствора. В каждую воронку добавляют по 10 см3 буферного раствора, перемешивают и приливают по 5 см3 нейтрального раствора метиленового голубого и по 15 см3 хлороформа, снова перемешивают в течение 2 минут.
Во второй ряд делительных воронок наливают 100 см3 дистиллированной воды и по 5 см3 кислого раствора метиленового голубого. В эти же воронки спускают отстоявшийся хлороформный слой из первого ряда воронок. В первые воронки наливают еще по 5 см3 хлороформа, взбалтывают в течении 2 минут и после отстаивания сливают хлороформные вытяжки во второй ряд делительных воронок. Эту операцию повторяют еще раз. Если хлороформ не окрашивается, значит извлечение комплекса окончено.
Содержимое второго ряда воронок взбалтывают в течении 2 минут и после расслоения спускают хлороформный слой в мерные колбы вместимостью 50 см3 через воронки с кусочками ваты для отделения возможно образовавшейся мути. В делительные воронки наливают еще по 5 см3 хлороформа, взбалтывают 2 минуты и после расслоения спускют хлороформ в мерные колбы. Эту операцию повторяют еще раз. Объем экстракта в мерных колбах доводят до метки хлороформом, перемешивают и определяют оптическую плотность окрашенных растворов на фотоколориметре с красным светофильтром (l=650 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 20 мм.