Экспериментальный способ оптимизации сред приемлем, но он очень длителен и не всегда оправдан, так как для того, чтобы учесть взаимовлияние отдельных компонентов при изменении их соотношения в среде, необходимо исследование многочисленных вариантов. Проще и целесообразнее вести такие исследования на основе математических методов планирования эксперимента.
Таким образом, способность бактерий образовывать внеклеточные протеиназы повысилась почти в 30 раз. Такие высокие показатели удалось достигнуть благодаря предварительной подработке некоторых компонентов сред, что убыстрило рост культуры и повысило её продуктивность. Подработка компонентов среды является эффективным и весьма распространенным приемом в технологии ферментных препаратов.
На основе культуральной жидкости, содержащей внеклеточные протеиназы, можно получить ферментные препараты различной степени очистки, используя разнообразные методы (см. рис. 1) – начиная от высушивания распылением готовой культуральной жидкости и до методов получения высокоочищенных ферментных препаратов и кристаллических протеиназ.
В таблице 4 представлены основные этапы выделения высокоочищенной протеиназы из технического препарата Г3х. Эта схема позволяет получить с высоким выходом (до 22 %) очищенный препарат внеклеточной нейтральной протеиназы из В. subtilis, которая относится к металлопротеиназам.
| Таблица 4 | ||
| Стадия выделения | Характеристика стадии | Выход активной протеиназы, % от исходной |
| Протосубтапин Г3х | Исходный материал для выделении протеазы | 100 |
| Растворение | Растворение протосубтилина в воде с рН 7,8 до концентрации сухого вещества 10 % | 92 |
| Отделение нерастворимой части | Фильтрование | 88 |
| Концентрирование | Очистка ультрафильтрацией и концентрирование до содержания белка в концентрате 3,5 – 4,0 % | 84 |
| Освобождение от пигмента | Обесцвечивание на ДЭАЭ-целлюлозе | 82 |
| Фракционирование ферментного комплекса | Хроматография на КМ-целлюлозе | 44 |
| Концентрирование элюата, получаемого при хроматографии | Обессоливание и концентрирование методом ультрафильтрации | 38 |
| Получение сухого высокоочищенного препарата нейтральной протеиназы | Сублимационная сушка концентрата | 22 |
Дальнейшие исследования протеолитических ферментов этого микроорганизма позволили установить в них четыре компонента, которые различались между собой по многим физико-химическим характеристикам (табл. 4), особенно по оптимуму рН. Из таблицы 6 видно, что протеиназа II обладает широким диапазоном действия в интервале рН от 7,5 до 11, протеиназа IV является сильнощелочной и т. д.
| Таблица 6 | |||||
| Компонент протеиназ | Молекулярная масса | Изоэлектрическая точка, pI | Оптимальный рН | рК | Кин, с-1 |
| I | 44 000 | 8,4 | 7,0 | 5,3; 8,8 | 0,9·10-3 |
| II | 40 000 | 8,8 | 7,5 – 11 | 5,7; 9,3; 9,8; 12,2 | 4,0·10-5 |
| III | 23 000 | 9,5 | 6,5 | 5,3; 7,7 | 3,3·10-4 |
| IV | 29 000 | 10,1 | 11,0 | 8,5 | 2,0·10-4 |
Наряду с этим очень продуктивным штаммом в промышленности всё больше используются другие бактериальные продуценты нейтральных и щелочных протеаз, которые являются мутантными вариантами или культурами, отобранными в процессе длительной естественной селекции. Среди промышленных бактериальных штаммов можно назвать: В. cereus, В. mesentericus, В. licheniformis (продуцент препарата субтилизин Карлсберга), В. amyloliquefaciens, В. stearothermophilus, В. subtilis (продуценты промышленных препаратов субтилизин BPNи субтилизин Novo) и некоторые другие.
Среди микроорганизмов – продуцентов протеиназ не менее важное место, чем бактерии, занимают актиномицеты и микроскопические грибы. Актиномицеты образуют внеклеточные протеиназы в значительных количествах, но они сравнительно редко используются в промышленных условиях. Очень многие актиномицеты одновременно с протеиназами образуют большое количество внутриклеточных антибиотиков, поэтому имеется возможность одновременно организовать два производства: антибиотиков – из биомассы продуцента и протеолитических ферментов – из жидкой фазы культуры. По такому принципу начиная с 60-х годов в Японии получают протеиназы на основе производства стрептомицина при промышленном культивировании Streptomycesgriseus. Протеазы S. griseus получают из фильтрата глубинной культуры путем избирательной сорбции катионообменными смолами. Протеаза после элюции и дальнейшей очистки очищается в 22 – 25 раз и известна на мировом рынке под названием проназы. Проназа является комплексным препаратом, состоящим, по данным различных авторов, из 11 – 13 протеаз: четырех нейтральных, грех щелочных протеиназ и 3 – 5 аминопептидаз и карбоксипептидаз. Это стабильный ферментный препарат, обладающий широкой специфичностью и способностью глубоко (на 70 – 90 %) гидролизовать субстрат до аминокислот. Только кератин и фиброин шелка с трудом гидролизуются проназой. Проназа также гидролизует различные пептиды, амиды и эфиры аминокислот. Она растворима в воде, слабых солевых растворах, водных растворах ацетона и спиртов с концентрацией не выше 50%. Оптимальный рН лежит в щелочной зоне – от 8 до 9; при рН ниже 4 и выше 10 протеазы инактивируются. Стабилизируется проназа ионами кальция, нейтральные протеиназы и пептидазы проназы являются металлоферментами. Пептидазы ингибируются ЭДТА, причем в присутствии ионов кальция и кобальта этот эффект снимается.
Препараты проназы широко используются в различных отраслях промышленности, особенно при щелочных значениях рН. Препараты прекрасно хранятся при комнатной температуре и полностью сохраняют свою активность в течение 3 и более лет. Препараты проназы содержат ферменты, очень близкие по механизму своего воздействия на субстрат к трипсину и химотрипсину. Поэтому в литературе можно встретить для трипсиноподобных протеиназ проназы с различными названиями: протеиназа В, БАЭЭ-гидролаза; трипсин S. griseus, трипсин проназы и т. д. Протеиназы проназы со свойствами, близкими к химотрипсину, в литературе называются: протеиназа С, протеаза А, n-нитрофенилацетатгидролаза 1 и 2, фракция В, эластазоподобный фермент, эндопептидаза В, химотрипсин проназы и др. Следует отметить, что химотрипсинподобный фермент S. griseus обладает высокой эластазной активностью. Вероятно, это комплексный фермент, имеющий в своем составе фрагмент эластазного фермента. Наличие в препаратах проназы пептидаз, вероятно, способствует более полному расщеплению белков и пептидов до аминокислот.
Микроскопические грибы очень длительное время использовались для синтеза нейтральных и особенно кислых протеиназ. Наиболее часто для этих целей применялись различные виды аспергилловых грибов: A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus, A. terricola, A. sojae, P. chrysogenum, Moniliasitophila. Эти микроорганизмы образуют протеазы, зона действия которых лежит в интервале рН от 4 до 10 с проявлением максимальной активности при рН, близком к нейтральному. Большой интерес представляют продуценты видов: A. awamori, A. saitoi, Rhizopusjavanicus, Rh. pygmaues, Penicilliumexpansum, P. sponolasum и др., которые образуют кислые протеиназы с оптимальным рН 2,0 – 2,5. Все кислые протеиназы по механизму воздействия на субстрат достаточно близки, но пока нет стройной гипотезы, объясняющей существо протекающей реакции и её механизм.
За рубежом выпускаются кислые пепсиноподобные протеиназы, используемые для гидролиза белков соевых бобов, для хлебопечения и в медицине для улучшения пищеварения. Наиболее широко для производства кислых пепсиноподобных внеклеточных протеиназ используются Aspergillussaitoi, Rhizopuschinensis и Penicilliumjanthinellum. Схема получения на основе этих культур препаратов классическая и особых отличий не имеет.
Подводя итог по характеристике протеолитических ферментов, следует подчеркнуть, что технология этих препаратов освоена наиболее широко. Это многотоннажное производство, объемы которого превышают по денежному выражению реализуемой продукции почти в 2 раза сумму реализации всех непротеолитических ферментов. Причем доля микробных протеаз составляет 1/2 общего объёма выпускаемых протеолитических ферментов. С учетом того, что из года в год область применения протеаз расширяется и объемы выпускаемой продукции возрастают, можно сказать, что это почти самое крупномасштабное производство в технологии ферментных препаратов. Проведены большие исследования протеаз, этому вопросу посвящены обширные работы, обзоры и монографии. В данном разделе книги сделана попытка лишь слегка коснуться основных особенностей производства протеолитических ферментных препаратов и подчеркнуть те стороны технологии, которые требуют ещё изучения и совершенствования.
2.4 Производственные стоки
Спуск ливневых и производственных сточных вод в канализационную сеть может проводиться только в соответствии с санитарными нормами промышленных предприятий («Санитарные нормы проектирования» СНиП II –32–74). Спуск воды из производственных корпусов должен осуществляться по трём отдельным канализационным устройствам: для отработанных чистых производственных вод (конденсатор, холодильники и т. п.); для загрязненных промышленных стоков; для фекально-хозяйственных вод. Условно чистые производственные воды должны быть предельно регенерированы с целью их повторного использования в производстве, и только в исключительных случаях допускается сбрасывание этих вод в канализацию. Производственные сточные воды, содержащие кислоты или щелочи, должны нейтрализоваться, после чего разрешается спуск их в заводскую сеть фокально-хозяйственной канализации. Спуск фекально-хозяйственных и загрязненных производственных сточных вод в поглощающие колодцы и буровые скважины запрещен.