2. Производство протеолитических ферментных препаратов
Ферменты, обладающие способностью гидролизовать белки, широко используются в самых различных отраслях промышленности, сельском хозяйстве и медицине. Протеолитические ферменты выпускаются промышленностью в большом количестве, это крупнотоннажное производство. Протеиназы применяются в пищевой технологии, где идет процесс с использованием микроорганизмов (дрожжи, молочнокислые бактерии и др.). Введение в процесс протеиназ позволяет в результате гидролиза белков обрабатываемого сырья обеспечить дрожжам нормальные условия жизнедеятельности, что улучшает весь технологический процесс, особенно в пивоварении, спиртовой промышленности, виноделии. В ряде исследований показано, что протеолитические ферменты могут использоваться в хлебопечении для уменьшения длительности замесов при производстве заварных сортов хлеба и специальных изделий, изготавливаемых из муки с сильной клейковиной. Внесение в тесто небольших количеств амилаз и протеиназ увеличивает газообразование, улучшает аромат, цвет корочки и мякиша, позволяет сократить процесс тестоведения. Широко применяются протеиназы для снятия различного рода белковых помутнений в пивоварении и виноделии и для ускорения фильтрационных процессов. Протеолитические ферменты используются для мягчения (тендеризации) мяса, мясных изделий, рыбы, что облегчает и ускоряет обработку полупродуктов, повышает их качество. В мясной, рыбной промышленности и в кулинарии используются не только микробные протеиназы, но и протеиназы, получаемые из растительного и животного сырья. Высокоочищенные протеолитические ферменты могут с успехом использоваться в крахмало-паточной промышленности для выделения особенно чистого крахмала без сопутствующих белков.
Комплексные ферментные препараты, содержащие протеиназы, используются в пищеконцентратной и консервной промышленности при приготовлении концентратов из трудно развариваемых круп, гороха, фасоли и др.
Протеииазы могут использоваться в кожевенной промышленности для обработки кож в процессе их обезволашивания и мягчеиия с большим эффектом: улучшается качество шкуры, сохраняется толщина готовой кожи, отделенная щетина может использоваться как вторичное сырье, а главное – резко улучшаются условия труда работающих. Используются протеиназы при обработке натурального шелка для процесса снятия белка с поверхности шелковой нити.
Самая большая потребность в протеолитических ферментах связана с их использованием в составе синтетических моющих средств (CMC). Особенно эффективна обработка протеиназосодержащими CMC больничного белья, загрязненного кровью и другими выделениями белковой природы.
Протеолитические препараты, особенно животного происхождения, широко используются в медицинской промышленности и медицине. Они применяются для приготовления питательных и диагностических сред, для изготовления ряда лечебных сывороток и вакцин. Протеиназы различной степени очистки используются в качестве лекарственных препаратов для регулирования процессов свертывания крови, при лечении воспалительных процессов, для восполнения недостатка ферментов в организме и т. д.
Протеолитические ферменты синтезируются практически всеми живыми существами. Эти ферменты очень широко распространены в природе. В промышленных целях как источник получения протеиназ используются животные ткани, растения и микроорганизмы. Животными тканями для получения протеиназ является собираемое на мясокомбинатах ферментное сырье, состоящее из поджелудочной железы и слизистой оболочки желудка. Из растений промышленный интерес представляют плоды дынного дерева, побеги и листья инжира и отходы переработки ананасов.
Наиболее широким и перспективным источником протеиназ являются микроорганизмы. Активными продуцентами протеиназ являются бактерии, микроскопические грибы и актиномицеты. Можно назвать сотни микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, которые используются при промышленном получении протеиназ. Они чаще всего относятся к родам Bacillus,Aspergillus, Penicillium, Streptomyces, Pseudomonas и некоторые другие. Более подробно о продуцентах будет сказано в разделе, посвященном рассмотрению особенностей производства протеолитических препаратов.
Субстрат. Субстратами для действия протеолитических ферментов являются пептиды и белки. К последним относятся простые белки, состоящие только из аминокислот, их называют протеинами, и сложные белки, в состав которых наряду с белковой частью молекулы входят соединения небелковой природы (углеводы, витамины, жиры и др.) – протеиды. Все эти соединения имеют большую молекулярную массу и сложны по строению.
Пептиды также могут быть субстратом для протеиназ. Они имеют более низкую молекулярную массу, чем белки, и по составу подобны простым белкам. Они могут быть либо продуктами неполного гидролиза белка, либо природными соединениями. Пептиды могут быть синтезированы в лаборатории и использоваться как специфические субстраты в аналитических работах для определения способности ферментов к разрыву вполне определенных пептидных связей.
До начала 50-х годов все протеолитические ферменты по механизму их действия на субстрат подразделялись на две группы: протеиназы и пептидазы. Считалось, что гидролиз белка протекает в две стадии: сначала под действием протеиназ белки гидролизуются до пептидов, а затем на пептиды действуют пептидазы и расщепляют их до аминокислот.
Позднее, в 60-х годах, протеолитические ферменты классифицировали на четыре подкласса. В настоящее время действует новая классификация, по которой протеиназы относятся к третьему классу четвертому подклассу. С тем чтобы исключить путаницу, все ранее существовавшие подклассы были отброшены и по новой классификации первому подклассу в разделе протеолитических ферментов присвоен номер 11 (КФ 3.4.11). Такие сложности в классификации связаны с тем, что катализируемая суммарная реакция одинакова для всех протеолитических ферментов. Причем ферменты не имеют строгой субстратной специфичности в обычном смысле этого слова – подавляющее большинство этих ферментов действует на все денатурированные и на многие нативные белки. По новой классификации протеолитические ферменты были разделены на две основные группы: пептидазы КФ 3.4.11 – 15 и протеиназы – КФ 3.4.21 – 24.
Пептидазы. В первой группе протеолитических ферментов – пептидазах – подразделение по подподклассам осуществляется на основе механизма расщепления пептидных связей в пептидах. К группе ферментов, входящих в 11-й подподкласс (КФ 3.4.11) – α-аминоацилпептидгидролазы – относятся те, которые гидролитически расщепляют первую с N-конца пептидную связь. Группа КФ 3.4.12 – гидролазы пептидиламинокислот или гидролазы ациламинокислот – объединяет ферменты, действующие на первую пептидную связь с С-конца. Ферменты группы КФ 3.4.13 – дипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды; групп КФ 3.4.14 – дипептидилпептид гидролазы – и КФ 3.4.15 – пептидилдипептидгидролазы – гидролизуют дипептиды соответственно с N- и С-конца. С 16-го до 20-го подподкласса в номенклатуре сделан пропуск с учетом будущих открытий ферментов, гидролизующих дипептиды.
Протеиназы. Вторая группа протеолитических ферментов – протеиназы – имеет четыре подподкласса (21 – 24), в котором все ферменты подразделяются в зависимости от особенностей механизма катализа, установленного по функционированию активного центра фермента, а также влияния рН на его активность. Специфичность к субстрату рассматривается лишь с позиции идентификации индивидуальных ферментов в пределах каждой из групп.
Сериновые протеиназы. К подподклассу 3.4.21 относятся протеиназы, для которых характерно наличие в каталитическом центре триады аминокислот: аспарагиновая кислота, гистидин и серии. В этот подподкласс внесены многие хорошо изученные протеийазы животного происхождения (химотрипсин, трипсин, тромбин, плазмин, эластаза и др.) и некоторые микробные протеиназы.
Тиоловые протеиназы. К подподклассу 3.4.22 относятся протеиназы, имеющие в активном центре SH-группу цистеина.
В подподкласс 3.4.22 вошел ряд важных протеиназ растительного происхождения, такие как папаин, фицин, бромелаин, химопапаин, и некоторые микробные протеиназы.
Кислые протеиназы. Они входят в подподкласс (3.4.23) и имеют оптимальный рН ниже 5, в каталитическом акте у этих ферментов участвуют остатки дикарбоновых аминокислот. Наиболее широко известны из этого подподкласса пепсин, катепсин и ряд кислых протеиназ грибного происхождения. В последний под подкласс (3.4.24) входят протеиназы, содержащие ионы металлов. В основном это различные микробные нейтральные протеиназы и некоторые протеиназы животного происхождения.
В классификации и номенклатуре протеолитических ферментов выделена ещё одна, третья группа протеиназ, которые включены в подподкласс 3.4.99. Это протеиназы с неизвестным механизмом катализа. В этот подподкласс внесено 26 ферментов, среди них много микробных протеиназ, но есть протеиназы и животного происхождения. Создание подподкласса 3.4.99 вызвано тем, что многие протеиназы обладают близкой, но не полностью изученной и определенной специфичностью. Они действуют на один и тот же субстрат, однако продукты гидролиза отличаются не только количественно, но и качественно.