по 10 и 1 см3 неразведенного продукта и ряда его разведений, если надо определить количество микроорганизмов, превышающее 3 клетки в 100 см3 продукта.
Все разведения и неразведенный продукт высевают параллельно в три пробирки с 10 см3 питательной среды. В среду нормальной концентрации высевают 1 см3, двойной концентрации – 10 см3.
При выявлении S.aureusв определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) с предварительным обогащением эту навеску (разведение) вносят в одну из питательных сред в соотношении 1:6 или 1:7.
При анализе пищевых продуктов с высоким содержанием NaС1 проводят посев продукта (или его исходного разведения) в сахарный бульон. Во всех других случаях для посева используют солевой бульон.
При выявлении S.aureusв определенной навеске продукта (или его эквивалентном разведении) без предварительного обогащения эту навеску (разведение) в количестве 0,1 г (или 0,2 см3) наносят на поверхность одной из селективно-диагностических сред. Посевы инкубируют в термостате при 36 ± 1°С в течение 48 ч, чашки Петри ставят дном вверх.
Для подтверждения роста микроорганизмов в жидких средах из них делают пересевы петлей на поверхность одной из селективно-диагностических сред, помещают в термостат при 36±1°С на 24–48 ч и затем проводят учет.
Характерные признаки роста S.aureusна плотных средах приведены ниже.
Агар Байрда–Паркера Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5 – 2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности
Агар молочно-солевой Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности
Агар яично-желточно – азидный и яично-желточно-солевой
Колонии черные, блестящие, круглые, диаметром 1,5–2,5 мм, окружены зоной лецитиназной активности
Колонии круглые, диаметром 2–2,5 мм, слегка возвышающиеся над поверхностью агара, с ровными края ми, окрашены в желтый, золотистый, лимонно-желтый, кремовый, палевый или белый цвет
Для подсчета количества S.aureusотбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний. Для подтверждения наличия в продукте стафилококка отбирают не менее 5 характерных колоний и пересевают на скошенный мясопептонный агар. Через 24 ч после термостатирования при 36+1°С определяют морфологию в мазках, окрашенных по Граму, способность коагулировать плазму крови кролика, образовывать каталазу и ферментировать мальтозу в анаэробных условиях.
S.aureus– грамположительные клетки шарообразной формы диаметром 0,6–1 мкм, располагающиеся чаще (но не всегда) в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.
Способность выросших микроорганизмов образовывать каталазу определяют по методу, указанному выше. S.aureusобразует каталазу. У грамположительных микроорганизмов, образующих каталазу, выявляют способность коагулировать плазму крови кролика. Для этого к плазме крови кролика добавляют по одной петле испытуемых культур, оставляя одну пробирку с разведенной плазмой незасеянной (контроль). Внесенную культуру тщательно размешивают и пробирку помещают в термостат при 36±1°С. Если через 6 ч коагуляции плазмы не произошло, то пробирку оставляют при 30+1°С на 24 ч. Если плазма не скоагулировала, то испытуемую культуру стафилококка относят к коагулазоотрицательной. Реакцию плазмокоагуляции считают отрицательной и в случаях, когда в плазме не образуются отдельные нити или сгустки либо появляются единичные нити (реакцию оценивают одним плюсом).
Реакцию считают положительной, если в плазме образовался небольшой компактный сгусток (два плюса); большой уплотненный сгусток (три плюса); плазма вся скоагулировала, сгусток не меняет своего положения при перевертывании пробирки (четыре плюса).
Для ускорения выявления коагулазоположительных стафилококков вместо агаровых культур допускается применять культуру, выращенную на мясопептонном бульоне. Ее используют для постановки реакции плазмокоагуляции спустя 2 ч после появления видимых признаков роста микроорганизмов. К 0,5 см3 разведенной плазмы добавляют 2 капли суточной бульонной культуры, учет результатов проводят в сроки от 30 мин до 2–4 ч. Реакцию оценивают плюсами (от одного до четырех).
Способность ферментировать мальтозу в анаэробных условиях определяют с целью дифференциации S.aureusот других коагулазоположительных видов – S. intermedius и S. hyicussubsp. hyicus(S.aureusферментирует мальтозу в анаэробных условиях, S. intermedius ферментирует ее слабо, S. hyicussubsp. hyicusне ферментирует). Культуры, подлежащие исследованию, высевают уколом петлей в среду Гисса с мальтозой. На поверхность среды наслаивают голодный агар высотой 2–2,5 см. Посевы инкубируют при 36±1°С в течение 48 ч. При ферментации мальтозы в анаэробных условиях с образованием кислоты цвет среды Гисса изменится.
Если в посевах обнаружены грамположительные кокки, способные коагулировать плазму крови, образующие каталазу, ферментирующие мальтозу в анаэробных условиях, то выявленные микроорганизмы относят к S.aureus.
При определении потенциальной энтеротоксичности выделенных культур S.aureusустанавливают их способность образовывать термостабильную нуклеазу. Для этого в среде с ДНК, разлитой в чашки Петри, вырезают асептически «колодцы» диаметром не более 4 мм, на расстоянии не менее 7–8 мм друг от друга. Культуры,
выросшие на мясопептонном бульоне после инкубирования при 36±1°С в течение 24 ч, прогревают на кипящей водяной бане 15 мин, охлаждают до комнатной температуры и вносят по 1–2 капли в «колодцы» пастеровской пипеткой. Засеянные чашки помещают в термостат при 36±1°С, результаты учитывают через 1,2 и 5 ч. При наличии термостабильной нуклеазы вокруг «колодцев» появляется ярко-розовая зона на синем фоне среды.
При окончательном анализе результатов бактериологического исследования на определенный вид (семейство, род) по ГОСТ 26670–91 надо учитывать следующее. Если при подтверждении характерных колоний обнаружено, что не менее 80% (т.е. не менее 4 из 5) из них принадлежат к S.aureus, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашках Петри, принадлежат к выявленным микроорганизмам. В остальных случаях количество выявляемых микроорганизмов определяют, исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных, взятых для подтверждения. Если при подтверждении колоний, полученных при пересеве с жидкой питательной среды, хотя бы в одной из 5 пробирок обнаружены выявляемые микроорганизмы, то такие пробирки с посевами считают положительными.
При определении общей бактериальной обсемененности продукта подсчитывают колонии в посевах на чашках Петри, где их выросло от 15 до 300, и вычисляют среднее арифметическое значение числа колоний во всех посевах одного разведения.
Если число колоний составляет от 15 до 300 в посевах не одного, а двух следующих друг за другом разведений, то вычисляют среднее арифметическое количество микроорганизмов по каждому из них отдельно. Если полученные результаты отличаются друг от друга более чем в 2 раза, то оценку проводят по результатам посева наибольшего разведения.
Если в одном из параллельных посевов одного разведения число колоний превышает 300, эти результаты используют для подсчета среднеарифметического значения. При числе колоний в параллельных посевах меньше 15 допускается определять суммарное число колоний и результат использовать для дальнейших расчетов. При этом количество инокулята т будет равно суммарному его количеству в параллельных посевах.
Полученные среднеарифметические значения округляют:
до числа, кратного 5, если среднее арифметическое число микроорганизмов менее 100;
до числа, кратного 20, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и оканчивается цифрой 5;
до числа, кратного 10, если среднее арифметическое число микроорганизмов более 100 и не оканчивается цифрой 5.
Количество микроорганизмов в 1 г (1 см3) продукта
M=N/m*C
где N – степень разведения навески; т – количество инокулята, внесенное на чашку Петри, см3; С – округленное среднеарифметическое значение числа колоний.
Результат определения выражают числом от 1,0 до 9,9 • 10n.
Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри в посевах одного разведения (или число подтвержденных колоний), меньше 15 (5), результаты выражают следующим образом: количество определяемых микроорганизмов в 1 г (см3) продукта меньше 15 (5), умноженное на N/т.
Допускается для приблизительного подсчета учитывать рост на чашках Петри, число колоний на которых меньше 15 (5). Доверительные интервалы для таких случаев указаны ниже.
Если рост микроорганизмов на чашках Петри отсутствует или при подтверждении микроорганизмы определенных семейств, родов или видов не обнаружены, то результат выражают как количество определяемых микроорганизмов в 1 г (1 см3) продукта меньше 1, умноженное на значение N/m.
Если среднеарифметическое значение числа колоний, выросших на чашках Петри, в посевах одного разведения превышает 300 (150), то результат выражают следующим образом: количество определяемых микроорганизмов в 1 г (1 см3) продукта больше 150 или 300, или 50, умноженное на значение К/т.
Результаты выявления микроорганизмов в определенной навеске (объеме или площади поверхности) выражают с указанием величины навески следующим образом: микроорганизмы обнаружены или микроорганизмы не обнаружены.
Наиболее вероятное число (НВЧ) стафилококков в 1 г (1 см3) продукта определяют по ГОСТ 26670–91, исходя из количества положительных проб (пробирок) с посевами, т.е. тех, в которых обнаружен рост. Для этого выбирают три самых высоких последовательных разведения, в первом из которых все три пробирки являются положительными, а в последнем (или последующем неоцениваемом) – отрицательными (например, 4, 2, 0 или 3, 2, 1, 0). Если после разведения, в котором все три пробирки были отрицательными, одна из пробирок большего (т.е. следующего за ним) разведения окажется положительной (например, 3, 2, 0, 1), то для определения НВЧ учитывают три наивысших разведения, начиная с того, в котором количество положительных пробирок было меньше трех (т.е. 2,0,1).