Больничные изоляты бактерий являются менее чувствительными к дезинфектантам по сравнению с типовыми и внеболъничными штаммами. В появлении и распространения устойчивых к ЧАС вариантов бактерий, вероятно, имеют значение описанные выше генетические механизмы резистентности и селекции устойчивых культур при длительном применении в больницах дезсредств на основе одной группы активно действующих веществ [12; С. 10].
Исследования проведены с использованием тест-объектов, контаминированных микробными культурами.
К новым дезинфектантам на основе ЧАС, в состав которых входили также этанол, полигуанидин, амин, не было обнаружено устойчивых вариантов бактерий. Асфен 381 оказался неактивным в отношении 20,0% псевдомонад. К рекомендованным для практического применения концентрациям Микробак-форте были устойчивыми от 9,1 до 40,9% энтеробактерий, от 18,9 до 24,3% псевдомонад и от 0 до 20,0% стафилококков. Септабик в 0,12% концентрации проявил недостаточную активность в отношении большинства изученных изолятов энтеробактерий и псевдомонад. После действия 0,3% концентрации дезинфектанта при 60 - минутной экспозиции выживали 15,4% энтеробактерий и 7,2% стафилококков [6; С. 92].
Таким образом, ЧАС как монопрепараты вследствие относительно ограниченного спектра и невысокого уровня антимикробной активности могут применяться для дезинфекции и очистки некритических поверхностей в клиниках, на предприятиях пищевой промышленности и общественного питания. Введение в состав дезсредств на основе ЧАС активно действующих веществ, характеризующихся другими механизмами действия, приводит к расширению спектра и повышению уровня активности, способствует замедлению процессов формирования у микробов устойчивости [14; С. 341].
В связи с появлением и распространением в природных средах устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий - возбудителей инфекционных болезней произошло снижение эффективности дезинфекционных мероприятий. Для предупреждения негативного действия этого явления на уровень заболеваемости инфекционными болезнями предложено установить контроль за циркуляцией устойчивых к дезинфектантам вариантов и изменять режим дезинфекции, исходя из полученных результатов. Ожидается, что введение этой меры должно повысить эффективность противомикробных мероприятий и затормозить селекцию и распространение устойчивых к дезинфектантам вариантов бактерий в окружающих человека экологических средах [15].
Реализация этого ценного предложения осложняется отсутствием адекватной методики. Применяемые в разных странах методики предназначены для определения активности дезинфектантов. Для испытания чувствительности (устойчивости) к дезинфектантам большого количества штаммов бактерий дикого типа они мало пригодны.
Для определения активности дезинфектантов в большинстве стран отдается предпочтение методикам с различными тест-носителями (батистовые тесты в методике, принятой в нашей стране, цилиндрики из нержавеющей стали в методике, принятой в США). Предлагаемая модификация относится к этой группе методов, но она специально предназначена для испытания чувствительности (устойчивости) бактерий к дезинфектантам.
2.1.1 Описание предлагаемой методики
Показания к применению методики: а) контроль за циркуляцией устойчивых к дезинфектантам штаммов бактерий в лечебно-профилактических учреждениях и эпидемических очагах; б) расследование причин неэффективности дезинфекционных мероприятий; в) установление причин микробной контаминации дезинфицирующих растворов; г) определение противомикробной активности дезинфектантов.
Материалы, необходимые для выполнения методики: испытуемые культуры, стандартные дезинфектанты; питательная среда АГВ для определения чувствительности бактерий к антибиотикам, специальные для отдельных групп бактерий среды, скошенный питательный агар; 0,9% раствор хлорида натрия, лошадиная сыворотка; нейтрализаторы дезинфектантов; штампы-репликаторы из нержавеющей стали с 50 штифтами, высота которых должна соответствовать 10 мм, диаметр 3 мм, площадь концевой площадки 7,1 см2, посевной объем 0,001 мл; опорные кольца для высушивания контаминированных репликаторов; бумажный эталон с номерами штифтов репликатора; термостат, пипетки, бактериологические чашки, стандарт мутности и др. [7; С. 48-50].
Для испытания на устойчивость используют чистые культуры бактерий, выделенные с помощью стандартных методик. Испытание проводят не позже 1-2 дней после выделения. Перед испытанием культуры засевают на скошенный питательный агар, выращивают в термостате при 37° С в течение 16-20 ч, смывают 0,9% раствором хлорида натри с 20% лошадиной сыворотки, стандартизируют плотность" в 2-109 бактерий/мл. Культуры испытывают раздельно; при массовых исследованиях допустимо объединение нескольких культур из одного объекта.
Поскольку подавляющее большинство дезинфектантов применяют в виде водных растворов, функциональные свойства которых определяются концентрацией присутствующего в них активно действующего начала, объективной характеристикой чувствительности к препарату служит концентрация дезинфектанта, вызывающая гибель 100% внесенных бактерий в фиксированное время. Такой подход в отличие от использования различных временных интервалов при фиксированной концентрации, кроме того, обеспечивая большую возможность количественной оценки и более привычен для практических бактериологов.
Дезинфектанты разводят стерильной теплой водой в асептических условиях в концентрациях, зависящих от используемых показателей.
По описанной в п. 1.3 методике готовят взвеси испытуемых культур.
Взвесями бактерий контаминируют штифты штампа - репликатора (одновременно в одном репликаторе может быть испытано 50 культур, а в случае смешанных культур - в несколько сколько раз больше). Для этого в лунки основания репликатора пастеровской пипеткой вносят взвеси испытуемых культур до образования вогнутого мениска (2-3 каш штифты крышки репликатора опускают в лунки, содержал взвеси бактерий, глубина погружения штифтов должна составлять 2-3 мм; спустя 5 мин крышку с штифтами снимают с лунок и помещают на опорное кольцо для высушивания бактериальной взвеси. Высушивают в асептических условиях на воздухе при комнатной температуре в затемненном месте.
Дезинфекцию штифтов проводят в лунках репликатора, в которые предварительно пипеткой вносят заданный раствор дезинфектанта. После этого в лунки с дезинфектантом осторожно опускают контаминированные бактериями штифты. Глубина погружения должна соответствовать примерно 4-5 мм, что контролируется ограничителем штифта.
После 10-минутной экспозиции в дезинфектанте штифты переносят в лунки штампа-репликатора, заполненные нейтрализатором, и выдерживают в нем 10 мин. Глубина погружения штифтов должна быть больше, чем уровень погружения штифтов в дезинфектант, что также обеспечивается ограничителем. Для нейтрализации хлорамина, диконита, перекиси водорода, препаратов йода используют 1% раствор тиосульфита натрия (гипосульфита хлоргексидина-0,6% раствор сульфонола, формалина- 1% раствор сульфита натрия, фенола и его препаратов-3% твин-80 (полисорбат) с 0,3% лецитина (или 1,5% эмулз куриного желтка).
В контроле роста бактериальных культур контаминированные описанным выше способом штифты погружают на 20 минут в лунки со стерильной водой, в контроле нейтрализатора контаминированные штифты екают на 10 мин в раствор нейтрализатора.
После истечения экспозиции опытные и контрольные репликаторы извлекают из нейтрализатора (воды) и концевые площадки штифтов репликаторов на 5 с слегка прижимают к поверхности АГВ или другой питательной среды на бактериологических чашках. На дне чашки чертой обозначают верх, который при посеве-реплике должен совпадать с чертой на крышке репликатора. Посевы выдерживают в термостате 37° С в течение 48 ч, после чего на фоне бумажного эталона с номерами культур учитывают наличие или отсутствие роста бактерий в зонах посевов-отпечатков. Культуру считают устойчивой ко взятой в опыт концентрации дезинфектанта, если в зоне отпечатка опытной чашки вырастает хотя бы одна колония при условии сплошного роста на отпечатках контролей. Для повышения достоверности каждой испытуемой культурой (или ее субкультурами) следует контаминировать 3 штифта или проводить исследование 3-кратно.
2.1.2 Сравнительная оценка предлагаемой и референтной методик
Определены правильность и воспроизводимость предлагаемой и референтной методик (ГОСТ 16263-70). В качестве референтной взята широко применяемая в России методика батистовых тест-объектов ВНИИДиС.
Правильность оценивали путем сравнения результатов 10-ратного определения минимальной бактерицидной концентрации (МБК) хлорамина Б для 5 штаммов S. aureus с помощью предлагаемой и референтной методик. X ±SXМБК хлорамина в предлагаемой методике равнялась (в г/100 мл): у039±0,04, 0,085+0,016, 0,089 ±0,011, 0,107 ±0,033, 1,074 + 0,011, в референтной соответственно: 0,038 ±0,05, 1,098±0,022, 0,116±0,024, 0,098 ±0,018, 0,106 + 0,021. Показатель р между сравниваемыми методиками во всех случаях был меньше 0,05, (-колебался от 0,16 до 1,33. Следовательно, различия между результатами предлагаемой и референтной методик недостоверны, что является показателем правильности первой.
Воспроизводимость (в серии и во времени) оценивали путем сравнения результатов 10-кратного испытания чувствительности 25 штаммов S. aureus к хлорамину с установлением ДБК в ряде. Мерилом разброса результатов вокруг средней арифметической служили среднеквадратическое отклонение (о) и коэффициент вариации (К). Как видно из таблицы, разброс результатов в обоих методиках относительно высок, что, вероятно, является как результатом гетерогенности популяции стафилококка по признаку чувствительности к дезинфектанту, так и следствием совершенства методик. Воспроизводимость предлагаемой методики по сравнению с референтной оказалась более высокой.