Начало образования спор зависит от особенностей штамма и температуры среды. При 30— 37 °С оно обычно заканчивается через 1 — 2 ч, при 24°С — через 16 ч, при 18°С затягивается до 70 ч. Ниже 15°С и выше 42С спорообразование не происходит. У некоторых штаммов интенсивно этот процесс начинается через 18—20 ч с момента засева среды и культивирования при 37 °С (Белоконов, 1970; Авакян, Кац, Павлова, 1972). На плотных средах споры образуются быстрее, чем в жидких. Процесс их формирования у хорошо спорулирующих штаммов обычно завершается на МПА через 48—72 ч.
Для прорастания спор необходимы аминокислоты (источник азота), углеводы (особенно глюкоза) и предшественники нуклеиновых кислот, 1-аланин н 1-тирозин (Земсков н соавт., .1972).
Морфологические изменения, свидетельствующие о начале прорастания спор, выявляются через 5—10 мин после засева их на питательную среду (температура 37°С). Они характеризуются набуханием спор и появлением по их периферии небольших светлых участков. Прорастающая спора теряет блеск, принимает шаровидную форму, затем вновь вытягивается и из одного конца ее выходит бацилла в направлении продольной оси, сбрасывая споровую оболочку; вышедшая бацилла похожа на материнскую сибиреязвенную бациллу, только у нее более закруглены концы.
Химический состав. В сухом остатке вегетативных клеток содержится 6,8% азота и 12—13,5% минеральной золы, в сухом остатке спор — соответственно 12,14 и 41,15%. Количество ДНК варьирует в зависимости от штамма. Наиболее высокий уровень РНК наблюдается у бактерии, находящихся в экспотенцеальной фазе роста. Бациллы сибирской язвы имеют ферменты: липазу, диастазу, протеазу, желатиназу. дегидразу, ци-тохромоксидазу, пероксидазу, каталазу, аргиназу и др.
Из тела микроба выделен соматический антиген, в состав которого входит полисахарид, содержащий в эквимолекулярных пропорциях N-ацетилглюкозамин и галактозу, а также незначительное количество 0-ацетила и остатки аминокислот.
В составе оболочки и капсулы сибиреязвенного микроба обнаружены 3 антигенных комплекса:
поверхностные антигены капсулы, являющиеся, по-видимому, пептидами, чувствительные к действию пепсина и частично трипсина;
собственно капсульные антигены, расположенные в основном слое капсулы, содержат вещества белково-полисахаридной природы, чувствительные к действию трипсина, хемотрипсина, гиалуронндазы и лизоцима;
антигены оболочки клетки, содержащие вещества как полисахаридной, так и белковой природы, чувствительные к действию лизоцима и трипсина (Левина и Кац, 1964; Лвакян н соавт., 1907).
По данным Е.П. Левиной и Л.П. Кац, антигены, обнаруживаемые с помощью флуоресцирующей сибиреязвенной сыворотки, локализованы в оболочке. Споры содержат аланинрацелеазу, нуклеозидрибозидазу, аденозиндезамнназу. У покоящихся спор эти ферменты обеспечивают слабый уровень энергетического обмена (дыхания).
1.2 Ферментативная активность
Из многочисленной группы аэробных бацилл, обитающих в почве, только Bacillus anthracis приобрела наиболее выраженные вирулентные свойства и способность вызывать у животных и человека болезнь со смертельным исходом. Она имеет ряд сходных морфологических и культуральных свойств с указанными непатогенными спорообразующими микробами. Особенно много идентичных признаков отмочено у Bacillus anthracis и Вас. сегeus. Имеется большой фактический материал относительно токсикогенности Вас. сегeusи её биохимической активности.
При электронно-микроскопическом исследовании у обеих бацилл (Шахбанов, 1975) выявлены как общие характерные, так и нетипичные признаки. Так, клеточная стенка у Bac. anthracis более толстая и внутри имеется фибриллярный материал, а у Вас. cereus на стенке расположены грибовидные выросты. И.Б. Павлова и Л.П. Кац (1966) выявили у Bac. anthracis более развитые мембранные структуры, что, по их мнению, вызвано большей активностью окислительно-восстановительных ферментов. Вас. cereus в отличие от Bac. anthracis быстро свертывает растворы желтка куриного яйца; имеет чрезвычайно активную лецитиназу. Она медленно редуцирует метиленовый синий, слабо восстанавливает нитраты и нитриты, вырабатывает желатиназу, а также протеазу и достаточно быстро гидролизует желатину и свернутую сыворотку.
1.3 Антигенная структура
Вас. anthracis изучена еще недостаточно.
Н.Ф. Гамалея (1928) установил, что в подкожном отеке, образующемся на месте введения возбудителя, содержатся ядовитые вещества, вызывающие при введении в кровь быструю гибель кролика. Watson, Bloom (1947) получили экстракты из отёков больных сибирской язвой кроликов. После внутрикожного введения животным экстрактов регистрировали такие же гистологические изменения, как и при заражении литыми бациллами. У кроликов эти экстракты вызывали образование иммунитета, в слабой степени он проявлялся у морских свинок и белых мышей.
Watson и Со11 (1947) выделили у бациллы две субстанции, они различались физическими, химическими и биологическими свойствами. Первая из них вызывала воспаление тканей, стремилась к аноду, вступала в реакцию с фосфатом Са, вторая имела протеиновую природу, была не токсична, обладала иммунизирующими свойствами.
В 1953 г. Smith и Со11 выделили сибиреязвенный экзотоксин из плазмы крови морских свинок, погибших от этой болезни, а затем и из культуральной жидкости при выращивании Вас. anthracis на жидкой питательной среде. Установлено, что токсин не имеет отношения, как полагали раньше, к капсульному веществу, состоящему из полиглютаминовой кислоты, но он обладает близким родством с протективным антигеном.
Smith (1958) выяснил, что токсин содержится не только в отечной жидкости, но и в достаточно высокой концентрации в плазме крови и в меньшем количестве в плевральном и перитонеальном экссудатах. Токсин вызывал не только местную воспалительную реакцию (отек) с явлениями разрушения тканей, но и гибель морских свинок и белых мышей от вторичного шока. Эта токсическая субстанция была обозначена как летальный фактор, а в 1955 г. названа сибиреязвенным токсином.
Сибиреязвенные антисыворотки, полученные от лошадей, ги-периммунизированных как капсульными, так и бескапсульными штаммами бацилл, подавляли действие токсина. Это указывало на то, что происхождение токсина не связало капсулой. Токсин также нейтрализовался сывороткой кроликов, иммунизированных проективным антигеном.
Evans (1954) выделил сибиреязвенный экзотоксин in vitro. Smith (1958) установил, что вирулентные и бескапсульпые вакцинные штаммы синтезируют одинаковые по силе токсины. Максимальной силой токсин обладал к I'/2 ч от начала инкубации. Количество его находилось в прямой зависимости от числа бактерии в культуре. По своим свойствам токсин, полученный в культуре, не отличался от такового, синтезируемого бациллами in vitro; он вызывал образованно антител у животных и нейтрализовался лошадиной противосибиреязвенной сывороткой.
В 1958 г. Smith определил, что у нативного сибиреязвенного токсина четко различаются отечный и летальный факторы. Molner и Strange (1960) разделили токсин на два фактора. Один из них проходил через стеклянный фильтр и обладал свойствами протективного антигена, второй задерживался на фильтре, но легко элюнировался путем обработки 0,1 М карбонатным буфером при рН 9,7. Оба фактора сами по себе не были токсичными, но их смесь проявляла выраженное токсическое действие — вызывала воспалительные реакции в коже морских свинок и гибель мышей. Установлено, что второй фактор состоит из двух антигенов.
Stanley и Smith (1961) показали, что, кроме указанных двух факторов (компонентов), имеется еще одни, серологически отличающийся от них; он присутствовал в токсине, образующемся как в организме, так и в культуре. Эти факторы были обозначены цифрами I, II и III. Веа11, Тау1ог, (1962) предложили другие обозначения: EF (эдематогенный, или воспалительный, фактор); РА (иммуногенный—протективный антиген) и LF (летальный фактор), которые соответствовали I, П и III факторам.
Следовательно, токсическими свойствами обладает смесь из I и II компонентов (увеличивается проницаемость капилляров, что обусловливает отек). Но компонент II имеет проективные свойства, вызывая нммуногенные процессы в организме. Добавление к нему компонента I значительно увеличивает его иммуногенность, но в смеси с компонентом III протективные свойства снижаются. Компонент III не обладает токсичностью, но при добавлении его компоненту II придает смеси летальные свойства. Все три компонента токсина составляют синергическую смесь, обладающую одновременно эдематогенным и летальным действием. Это показывает, что токсин сибиреязвенных бацилл — трехкомпонентная система. Полный комплекс сибиреязвенного токсина, синтезируемого in vitro, нейтрализуется лечебным противосибиреязвенным глобулином (Федотова, Уланова, 1970).
Все три компонента сибиреязвенного экстрацеллюлярного токсина обладают антигенными свойствами и серологически активны. Токсин, синтезируемый in vivo, отличается от токсина, получаемого in vitro, более быстрым летальным действием и трудностью обнаружении.
Выяснено, что у возбудителя сибирской язвы имеется ряд антигенов: полисахаридный комплекс; капсульный полипептид; экзотоксин, в состав которого входит три компонента — воспалительный, иммуногенный (протектнвный антиген) и летальный. Каждый из микробных агентов (токсины, поверхностно-активные •вещества, нуклеиновые кислоты н пр.) взаимодействует лишь со строго определенными молекулярными мишенями в атакуемых клетках. Они воздействуют лишь на те молекулы, с которыми у них имеется химическое родство, дополненное соответствием структур и функции, т. е. химической комплементарностыо. Если подходящих мишеней нет, то микробная атака неэффективна. В этом и заключена тайна наследственного иммунитета. Изменение варианта расположении комплиментарных аминокислот (единичных из множества) создает невосприимчивость (Румянцев, 1984).