4. Антигенные особенности
Листерии имеют два типа антигена: соматический (О-Аг) и жгутиковый (Н-Аг). По структуре пяти термолабильных жгутиковых (Н-) и: четырнадцати термостабильных углеводных соматических Аг выделено 16 сероваров. Три серовара (4b, l/2b, 1/2а) вызывают 90% всех случаев листериоза человека (Радчук, Дунаев, 1991).
Листерии имеют антигенное родство со стафилококками, энтерококками, сенной палочкой и особенно с возбудителем свиной рожи (эризипелоид), что затрудняет серологическую диагностику болезни (Черкасский, 2002).
5. Классификация и таксономия
Домен: Bacteria
Филум: Firmicutes
Класс: Bacilli
Порядок: Bacillales
Семейство: Listeriaceae
Род: Listeria
Типовойвид: Listeria monocytogenes..
ВопределителебактерийБерджи (1997), род Listeria включаетоколо 7 видов: Listeria monocytogenes , Listeria welshimeri, Listeria grayi, Listeria murrayi, Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria selligeri. Только L.monocytogenes патогенна для человека и животных, а L.ivanovii – для животных. Хотя известно не менее 16 сероваров L.monocytogenes, большая часть случаев заболеваний связана с сероварами 4b, 1/2а, 1/2b.
6. Сходство, различия, дифференциация с близкородственными
таксонами
Дифференцирующие признаки родов аспорогенных грамположительных палочек правильной формы изложены в определителе бактерий Берджи (1997).
7. Среды для выделения и первичной идентификации
Выделение культуры и ее идентификация являются необходимыми для окончательного подтверждения диагноза листериозной инфекции. Для выделения листерий из клинического материала и продуктов питания используют селективные факторы. Наибольшее значение имеют температурный фактор и селективные добавки. Метод холодового обогащения при температуре +4oС, основанный на психрофильности листерий, весьма эффективен, но из-за длительных сроков инкубации (10-60 дней) не может быть рекомендован для клинической диагностики. В современных схемах выделения листерий обычно используют инкубацию при температуре 30oС в течение 24-48 ч в бульоне с селективными добавками для обогащения исследуемого образца (Тимаков, 1983).
Среди широкой гаммы селективных агентов, использовавшихся в разное время для выделения листерий, наибольшее значение сохраняют ингибиторы сопутствующей микрофлоры и дифференцирующие индикаторы: теллурит калия, налидиксовая кислота, хлорид лития, акрифлавин, эскулин, красители (фенилрот), антибиотики (цефтазидим, полимиксин B), циклогексимид (Тартаковский, 2002).
Наибольшее распространение для выделения листерий получили Оксфорд агар и PALCAM агар. В состав Оксфорд агара входят следующие селективные добавки (в г/л): эскулин – 1,0; цитрат железистого аммония – 0,5; хлорид лития – 15,0; циглогексимид – 0,4; колистин – 0,02; акрифлавин – 0,005; цефотетан – 0,002; фосфомицин – 0,01. В состав PALCAM агара входят (в г/л): эскулин – 0,8; цитрат железистого аммония – 0,5; хлорид лития – 15,0; акрифлавин – 0,005; полимиксин В – 0,01; цефтазидим – 0,02; фенилрот – 0,08 (Кареткина, 2008).
В качестве обогатительного бульона обычно используют различные варианты триптиказосоевого бульона с дрожжевым экстратом и селективным компонентом, включающим солянокислый акрифлавин (0,02-0,01 г/л), налидиксовую кислоту (0,05-0,01 г/л) и циклогексимид (0,05-0,01 г/л).
Схемы выделения листерий в зависимости от степени контаминации и количества листерий в исследуемом материале включают либо непосредственный высев на селективный агар, либо обогащение исследуемого образца на селективном бульоне при температуре 30oС в течение 24-48 ч с последующим высевом на селективный агар (Поздеев, 2006).
На Оксфорд агаре вырастают черные колонии L.monocytogenes, окруженные черным ореолом.
На PALCAM агаре колонии листерий серо-зеленые с черным вогнутым центром (рис. 3). Для них также характерен черный ореол на красном фоне агара. Последующий анализ характерных колоний, утилизирующих эскулин (в результате чего и происходит почернение среды), позволяет на основании ограниченного числа тестов идентифицировать культуру L.monocytogenes (Черкасский, 2002).
Весьма информативен САМР-тест, в котором культура L.monocytogenes дает положительную реакцию, образуя зону усиления гемолиза с гемолитическим штаммом Staphylococcus aureus и, в большинстве случаев отрицательную с Rhodococcus equi на чашках с кровяным агаром. Для идентификации листерий в качестве дополнительных тестов используют агглютинацию с поливалентной листериозной сывороткой и фаготипирование с помощью диагностичесого набора типовых листериозных бактериофагов (L2A и L4A), лизирующих 60-80% выделенных культур листерий (Тартаковский, 2002).
8. Внутривидовая и межвидовая идентификация
Дифференцирующие признаки видов рода Listeria представлены в определителе Берджи (1997)
Особое значение имеют тесты, позволяющие идентификацию L.monocytogenes совместить с дифференциацией от других непатогенных для человека листерий (рис. 5). L.monocytogenes формирует рамнозу и не утилизирует ксилозу и маннит, обладает гемолитической активностью на кровяном агаре (Тартаковский, 2002).
Анализ серологической структуры листерий показал, что она крайне неудобна для диагностики. Серотипы листерий не являются видоспецифическими. Они могут быть общими для разных видов листерий, независимо от их патогенности для человека. В сочетании с традиционной для серологических методов исследования относительно низкой чувствительностью и специфичностью, ретроспективным характером диагностики и широким распространением бактерионосительства при листериозе этот недостаток значительно снижает область применения серологических методов. L.monocytogenes имеет одну или несколько общих антигенных детерминант с другими видами листерий, кроме L.welshimeri. Поэтому само по себе установление серотипа без применения иных методов не позволяет установить диагноз инфекции, вызванной L.monocytogenes (Черкасский, 2002).
Наиболее перспективным для серологической диагностики представляется определение антител к секретируемому фактору патогенности листерий – листериозину О. Но даже эту более специфичную методику авторы рекомендуют использовать только для выявления неинвазивных бессимптомных форм болезни при эпидемических вспышках листериоза (Кареткина, 2008)
9. Способы ускоренной индикации в объектах внешней среды и в
организме животного
Практически весь спектр современных методических подходов пытались использовать для ускоренного выявления листерий: иммунофлюоресценцию, иммуноферментный анализ, моноклональные антитела, радиоиммунологический метод, ДНК-зонды, ПЦР, проточную цитометрию и др. Однако в клинической диагностике листериоза они не нашли применения (Радчук, Дунаев, 1991).
Основная область использования экспресс-методов – выявление листерий в продуктах питания. Однако и здесь приоритет в соответствии с международными и национальными регламентами стран – экспортеров продовольствия принадлежит классической бактериологии, хотя в дальнейшем поиск новых высокоспецифичных антигенных и нуклеотидных маркеров может изменить ситуацию (Тартаковский, 2002).
При анализе клинического материала (ликвора, крови, околоплодной жидкости, плаценты) перспективно применение ПЦР с использованием праймеров на основе последовательностей гена листериозина О (hly) или фосфолипазы (plcA). Метод обладает высокой чувствительностью и позволяет выявить возбудитель в течение нескольких часов. Хотя фрагмент хромосомы, на котором расположены гены, кодирующие факторы патогенности L.monocytogenes, используемые в ПЦР, сходен с аналогичным фрагментом L.ivanovii и L.seeligeri, в наших экспериментах мы не наблюдали перекрестных реакций. Однако опыт применения ПЦР при анализе клинического материала недостаточен для практических рекомендаций по его использованию в качестве основного метода диагностики (Поздеев, 2006).
10. Медицинское и ветеринарное значение. Патогенность
Патогенные листерии обладают набором биологически активных молекул и белков (листериолизин О, фосфолипаза С, лецитиназа, интерналин, белки ActA и PrfA), позволяющим активно проникать и размножаться не только в фагоцитах, но и эндотелиальных и эпителиальных клетках. Способность перемещаться по цитоплазме клетки за счет полимеризации актина и переходить из клетки в клетку «продавливая» мембрану позволяет патогенным листериям легко преодолевать барьеры слизистой оболочки кишечника без контакта с антителами, комплементом и нейтрофилами. Поступая в кровяное русло возбудитель может перемещаться в главные места локализации поражая мозг и плаценту (Литвин, 1996).
Если раньше листериоз считали типичным зоонозом, при котором источником возбудителя инфекции являются различные животные, то в настоящее время его относят к сапрозоонозам, а основным источником и резервуаром возбудителя инфекции признаны объекты внешней среды, природные субстраты, в которых листерий способны размножаться — прежде всего почва. Листерий выделяют также из растений, силоса, пыли, водоемов и сточных вод (Кареткина, 2008).
Основной путь заражения человека листериозом — пищевой; люди заражаются при употреблении вышеперечисленных продуктов питания, не прошедших термической обработки. Повышенную опасность представляют мягкие сыры, а также продукты быстрого приготовления (“фаст фуд”)—сосиски "хот-дог", гамбургеры и др. Возможны также другие пути заражения: контактный (от инфицированных животных и грызунов), аэрогенный (в помещениях при обработке шкур, шерсти, а также в больницах), трансмиссивный (при укусах насекомых, в частности клещей), половой. Особое значение имеет возможность передачи листерий от беременной женщины плоду — либо во время беременности (трансплацентарно), либо при контакте новорожденного с родовыми путями родильницы (интранатально). Листерий могут быть причиной внутрибольничной инфекции. У животных возбудители в основном передаются алиментарпым путем; менее действенный путь передачи инфекции — трансмиссивный (при укусах клещей) (БМЭ,1980).