Смекни!
smekni.com

Биогенез мембран (стр. 3 из 5)

Известны также случаи, когда сигнальная последовательность закрепляет зрелый белок в противоположной ориентации, т. е. N-конец оказывается обращенным наружу. В качестве примера можно привести цитохром Р450 микросом крысы.

Каким-то образом эти сигналь-ные/якориые последовательности «проталкивают» свой N-коиец через мембрану и останавливают трансляцию, так что основная часть белка остается в цитоплазме. Отмечалось, что в некоторых из этих случаев сигнальные последовательности «старт/стоп» несут по крайней мере одни отрицательный заряд в п-области. Однако для встраивания указанных мембранных белков, как и белков обычного типа, используется одинаковый аппарат переноса — СРЧ. Возможно, наличие отрицательного заряда облегчает самопроизвольный или опосредованный белком перенос N-концевых остатков через мембрану.

Как мы уже отмечали, сигнальные последовательности не обязательно находятся на N-конце белковой молекулы и могут направлять перенос обоих фланкирующих домеиов, по крайней мере в случае искусственных гибридных белков. Уникальным примером такого рода является овальбумин, секреция которого детерминируется неотщепляемой внутренней сигнальной последовательностью. У многих мембранных белков эндоплазматического ретикулума неотщепляемые сигнальные последовательности тоже расположены в средней части полипептидиой цепи и играют роль трансмембраниых якорей. В качестве примера можно привести асиалогликопротеиновый рецептор. Внутренняя сигнальная последовательность этого белка использует тот же аппарат переноса, что и N-концевая последовательность; и действительно, в искусственных гибридах эта внутренняя сигнальная последовательность функционирует как обычная N-концевая последовательность. Примерами белков с внутренней неотщепляемой сигнальной последовательностью, которые имеют многочисленные трансмембраниые сегменты и N-конец которых находится на внутренней стороне мембраны, служат переносчик глюкозы и анионный переносчик белок полосы 3. Напротив, у опсина, тоже содержащего внутренний неотщепляемый сигнальный пептид, N-конец находится с наружной стороны мембраны. Этот внутренний сигнал (предположительно первый трансмембранный сегмент) протягивает гидрофильный аминокислотный домен (36 аминокислотных остатков) через мембрану, и, таким образом, его ориентация противоположна той, которая наблюдается в более общем случае при переносе полипептида, начиная с С-конца. Причина такого поведения опсина неизвестна; возможно, важную роль играет природа N-концевого пептида.

Итак, от небольших изменений в сигнальных последовательностях зависит, будет ли «белок-пассажир» секретироваться в полостьэндоплазматического ретикулума или он останется прикрепленным к мембране, и какой будет ориентация N-конца мембранного белка. Было показано, что существуют все возможные топологические варианты. Важным моментом является то, что во всех случаях сборка осуществляется при помощи одного и того же аппарата.

2.3 Стоп-сигналы переноса

Как отмечалось в предыдущем разделе, для неотщепляемых сигнальных последовательностей, которые играют роль N-концевых якорей в образовавшемся мембранном белке, характерно наличие относительно длинных гидрофобных участков. Отсюда следует, что перенос может останавливаться просто при наличии протяженного гидрофобного участка, который способен образовать трансмембранную а-спираль. В пользу такого предположения свидетельствуют некоторые экспериментальные данные. Например, с помощью рекомбинантной ДНК в среднюю часть белка £. coli, в норме секретирующегося через плазматическую мембрану, встраивали гидрофобные сегменты. Если их длина была не менее 16 аминокислотных остатков, то транспорт белка блокировался и он оставался присоединенным к плазматической мембране. Можно возразить, что в данном случае речь идет о бактериальной системе, но, как мы увидим ниже (см. раздел, посвященный сигнальным последовательностям бактерий), механизмы переноса в про- и эукариотических системах, по-видимому, сходны. Далее были сконструированы варианты G-белка вируса везикулярного стоматита с измененными мембранными доменами. Длина гидрофобного сегмента могла составлять не 20, а 8 остатков, при этом полипептид оставался трансмембранным, хотя транспорт в плазматическую мембрану блокировался. Таким образом, природа стоп-сигнала переноса точно не известна. Необходимо выяснить два вопроса: 1) участвуют ли в остановке процесса специфические белки аппарата переноса; 2) определяется ли остановка переноса гидрофобиостью стоп-сигнала или какими-то более тонкими факторами? Было показано, что участки стоп-сигнальиой последовательности, ответственные за блокирование переноса через эндоплазматический ретикулум, могут никак не влиять на транспорт через мембрану хлоропласта. Это означает, что упомянутые два процесса могут существенно различаться.

Определение старт- и стоп-сигналов подразумевает линейную схему переноса, начинающегося с N-конца; об этом свидетельствует поведение простых систем. Однако оказалось, что последовательности, которые блокируют перенос в одном случае, могут инициировать его в другом.

Следовательно важна не только последовательность но и ее окружение в полипептиде.


2.4 Сигнальные пептидазы

Для удаления временных N-концевых сигнальных пептидов необходимы специфические белки. Наиболее полно охарактеризованы сигнальные протеазы из Е. coli. Большинство экспортируемых белков Е. coliсодержат сигнальный пептид, который отщепляется на периплазматической поверхности внутренней мембраны с помощью лидер-пептидазы. Для переноса белков через внутреннюю мембрану эта пептидаза не нужна, но она необходима для высвобождения экспортируемого белка из цитоплазматической мембраны. Invitro очищенный фермент мог функционировать, будучи включенным в липосомы. Специфичность расщепления весьма высока, но не определяется исключительно аминокислотной последовательностью вблизи сайта расщепления.

Сигнальная пептидаза, функционирующая в эндоплазматическом ретикулуме, имеет ту же специфичность, что и соответствующий фермент Е. coli, что неудивительно, если учесть сходство сигнальных последовательностей. Была очищена сигнальная пептидаза из микросом эукариот. Показано, что она ассоциирована с другими полипептидами, возможно имеющими отношение к механизму переноса.

У Е. coliимеется вторая сигнальная пептидаза, участвующая в процессинге пролипопротеинов. Эти полипептидные компоненты оболочки Е. coliзамечательны тем, что при созревании их N-конец модифицируется с помощью глицерида. Пролипопротеи-новая сигнальная пептидаза также находится в цитоплазматической мембране. После отщепления сигнальный пептид остается в цитоплазматической мембране и разрушается с помощью мембра-носвязанного фермента протеазы IV.

В митохондриях и хлоропластах должно присутствовать несколько сигнальных пептидаз, поскольку процессинг происходит более чем в одном компартменте . Растворимую пептидазу из митохондриального матрикса удалось частично очистить, но охарактеризована она не полностью.

2.5.Белки необходимые для узнавания сигнальных последовательностей

1. Сигнал-распознающая частица (СРЧ). Это растворимый рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из шести разных белков и молекулы. СРЧ необходима для инициации переноса. Она связывается с сигнальной последовательностью образующегося полипептида во время его синтеза на рибосоме. Для препролактина, например, константа диссоциации составляет 1 нМ [11%]. С помощью метода фотохимического сшивания был идентифицирован один из полнпептидов (54 кДа), непосредственно взаимодействующий с сигнальной последовательностью предшественника. По некоторым данным, полученным для бесклеточных систем, связывание СРЧ ингибирует трансляцию или вызывает ее задержку. Впрочем, не исключено, что этот феномен является артефактом. Во всяком случае, как было показано на модельных опытах, его не обязательно привлекать для объяснения кинетики переноса белков invivo [11%]. Одна из вероятных функций СРЧ состоит в предотвращении неправильного свертывания образующегося полипептида, которое может блокировать перенос (например, из-за экранирования сигнальных последовательностей). Задержка трансляции должна уменьшать вероятность такого ошибочного свертывания и, следовательно, увеличивать эффективность переноса белков.

Некоторые небольшие белки (<8,5 кДа) транспортируются в эндоплазматический ретикулум независимо от СРЧ. В их число входят препропептид GLa лягушки, препромелиттин (оба они являются предшественниками секретируемых белков) и пробелок оболочки фага М13. Во всех этих примерах конформация предшественника такова, что белки должны оставаться способными к переносу даже в отсутствие СРЧ и рибосом.

2. Рецептор СРЧ, или стыковочный белок. Комплекс СРЧ/ рибосома/образующаяся полипептидная цепь транспортируется в шероховатый эндоплазматический ретикулум, преодолевая энергию сильного взаимодействия между СРЧ и мембраносвязанным рецептором СРЧ, называемым также стыковочным белком. Рецептор СРЧ содержит субъединицу с мол. массой 73 кДа, присоединенную N-концом к мембране. Вероятно, рибосома также связывается со специфическими рецепторами, присутствующими в мембране.

3. Рецептор сигнальной последовательности. Сигнальная последовательность на образующейся полипептидной цепи перемещается от СРЧ ко второму рецептору, находящемуся в мембране и называемому рецептором сигнальной последовательности. Об этом свидетельствуют результаты опытов по фотохимическому сшиванию, в которых используется метка, связанная с сигнальной последовательностью препролактина. Предполагаемый мембраносвязанный рецептор представляет собой гликопротеин с мол. массой 35 кДа. Возможно, он образует часть канала, через который осуществляется перенос. С помощью такого же подхода с использованием поперечной сшивки и синтетического сигнального пептида был обнаружен еще один кандидат на роль рецептора сигнальной последовательности (45 кДа). Связь между этими двумя белками неизвестна и функции их до конца не установлены. Как только образовавшаяся полипептидная цепь связывается с мем-браносвязанным рецептором, СРЧ и ее рецептор могут освободиться от рибосомы и принять участие в новом цикле. О предполагаемом канале, участвующем в переносе, ничего не известно; очистка его является довольно сложной задачей.