Смекни!
smekni.com

Методы культивирования возбудителя ранней пятнистости и оценки устойчивости растений к заболеванию (стр. 3 из 4)

В 1979 г. Уайт обнаружил, что накопление PR белков и устойчивость к TMV можно индуцировать путем обработки растений табака салициловой кислотой (SA), аспирином (ацетил SA), или бензойной кислотой. Доказательства, что SA – это сигнал для индукции SAR поступили также из двух публикаций 1990г. Малами показал, что концентрация эндогенной SA возрастает в тканях растений после инфицирования табака вирусом TMV, и этот рост кореллирует с индукцией PR генов [6].

Необходимость SA в качестве эндогенного сигнала для SAR было показано Гаффнеем, он использовал бактериальный ген nahG, кодирующий салицилат гидроксилазу, которая удаляет SA путем превращения ее в катехоламин. Трансгенный табак, экспрессирующий ген nahG накапливал очень мало SA после атаки патогена и не экспрессировал PR белки. [5, 6]

Растения, которые не реагируют на SA были выделены в мутантные линии, также они несут мутации по одинаковым генам NPR1/NIM1 (NON-EXPRESSER OF PR GENES1/NONINDUCIBLE IMMUNITY1) [6].

1.3.1 Природа системного сигнала

Салициловая кислота

Салициловая кислота – фенольное соединение, важный молекулярный эффектор. Она регулирует ряд важных процессов: термогенез, защитные ответы на атаки патогенов, синтез этилена и созревание плодов. Также существуют данные, что SA участвует в регулировании ответов растений на абиотические стрессы, в частности УФ излучение и озон [15].

SA – системный сигнал для SAR. Исследования показали, что большинство накапливающейся SA (69%) было синтезировано и экспортировано из инокулированных листьев. В других исследованиях было показано, что SA была найдена и в инфицированных листьях и синтезирована de novo [6].

Последние данные подтверждают, что сигнализирование может происходить и за счет преобразования SA в летучее соединение метиловый салицилат, который может вызвать устойчивость не только в незараженных частях этого самого растения, но также и у соседних растений [6].

Синтез SA

SA может быть синтезирована в растениях путем превращения фенилаланина в транс-коричную кислоту, которая синтезирована ферментом фенилаланин аммиак-лиазой (phenylalanine ammonia-lyase или PAL). Фермент PAL является светоиндуцируемым. Поэтому в темноте накопление SA происходит медленно, а защитные реакции протекают с низкой интенсивностью. Недавно было показано, что SA может также синтезироваться из бензойной кислоты (ВА), которая может быть гидраксилированна в SA [1].

Также было показано, что как и у бактерий SA может синтезироваться из хоризмата через изохоризмат. Экспрессия бактериальных ферментов, катализирующих эти реакции изохоризмат синтаза 1 (ICS1) и изохоризмат пируват лиаза 1 (IPL1), в табаке и Arabidopsis привело к повышенному накоплению SA и устойчивости к патогену. Изохоризматный путь синтеза в растениях – главный источник синтеза SA.

SA можно обнаружить в двух формах в растении: (i) свободная SA, которая возможно имеет сигнальную функцию и (ii) главная запасающаяся форма Я-O-D-глюкосалициловая кислота (SAG) [5]. Этот гликозид ассоциирован с клеточной стенкой и расщепляется специфической в-гликозидазой. При действии стрессов нетравматического типа происходит высвобождение в-гликозидаз клеточной стенки. Затем происходит расщепление гликозида и высвобождению свободной SA. Таким образом, превращение SAG в свободную и активную SA может значительно повлиять на сигнальную передачу SA [1].

Транспорт системного сигнала

SA была обнаружена во флоэме нескольких видов растений, это позволило предположить, что именно это вещество является флоэмно-транслоцируемым сигналом. Эксперименты подтвердили, что сигнал SAR инициируется в инокулированных листьях, и транспортируется по проводящей системе (флоэма) к верхним листьям [1, 6].

Активные формы кислорода (ROS)

Существует несколько салицилат-связывающих белков. Главными мишенями для внеклеточной SA являются внеклеточные каталазы и пероксидазы. Присоединяясь к молекулам этих ферментов, SA изменяет их каталитическую активность и запускает окислительную вспышку – резкое усиление синтеза активных форм кислорода. Салициловая кислота является ключевой молекулой, запускающей в растительном организме этот процесс [1].

Во внеклеточном пространстве накапливается перекись водорода: HO2 + O2∙ ─ + Н+ ↔ Н2О2 + О2 либо 2O2∙ ─ + 2Н+ ↔ Н2О2 + О2, это приводит к накоплению других активных форм кислорода – супероксидного аниона (O2∙ ─), гидроксильного радикала, синглетного кислорода и др. Во внеклеточном пространстве растения происходит окислительная вспышка, она разрушительно воздействует на патогенные микроорганизмы.

Поскольку H2О2 не имеет неспаренного электрона, она может пересекать биологические мембраны. Протонирование O2∙ ─, которое происходит более легко при низком рН, дает гидропероксильный радикал HO2, он может пересекать биологические мембраны примерно так же эффективно, как и H2О2. HO2 может непосредственно атаковать жирные кислоты, и, как показано, превращает линоленовую, линолевую и арахидоновую кислоты в перекиси липидов.

Также перекись водорода является главным вторичным мессенжером сигнала индуцирования устойчивости. SA запускает экспрессию PR-генов благодаря ей. Перекись водорода способна индуцировать активность ряда важных ферментов, таких как NADH-дегидрогеназ (NADH-DH) хлоропластов, что также играет определенную роль в генерировании SAR.

Второй группой салицилат-связывающих белков являются пероксидазы - регуляторные ферменты. Кислые пероксидазы клеточных стенок способны связывать SA, фермент начинает генерировать перекись водорода с использованием NADPH.

Лигниназы сохраняют свою пероксидазную активность на прежнем уровне или даже повышают ее.

Активные формы кислорода крайне опасны для самого растительного организма, поэтому в растении существуют надёжные механизмы регуляции окислительной вспышки. Протекание окислительной вспышки допускается только во внеклеточном пространстве, а внутри клеток этот процесс подавляется компонентами антиоксидантной системы [1].

Альвазер и другие обнаружил, что H2O2 накапливается в маленьких группах клеток в неинокулированных листьях Arabidopsis после инфицирования его авирулентным штаммом P. syringae. Эти микровспышки наблюдаются на протяжении двух часов после начальной окислительной вспышки в инокулированных тканях, затем наблюдается формирование микроскопических HR повреждений. Используя каталазу чтобы удалить H2O2 или DPI чтобы ингибировать NADPH оксидазу, было показано, что обе окислительные вспышки необходимы для индуцирования SAR. Авторы предполагают, что микровспышки ROS могут акивировать защингые реакции на низком уровне во всем растении [6].

Липидные сигнальные молекулы

Новые работы подтверждают, что липидные молекулы могут быть мобильными сигналами для SAR. Мальдонадо показал, что мутанты dir1 (defective in induced resistance 1) развивают нормальную местную устойчивость к патогену, но не способны развивать SAR или экспрессировать PR белки в системных листьях. Таким образом, дикий тип dir1, который имеет сходство с липидным транспортом белков (LTPs), может участвовать в генерации или передаче мобильного сигнала.

Внеклеточное расположение LTPs подразумевает наличие мембранных рецепторов (PM), участвующих в передаче сигнала [6].

Регуляторный белок NPR1

Ключевой регулятор в развитии SAR является NPR1-белок. В норме NPR1 экспрессируеся в растении в малом количестве, но после проникновения патогена и обработки SA его уровень повышаетя в два – три раза. Он имеет две белок-белковые зоны взаимодействия, анкириновые повторности и BTB/POZ (Broad-Complex, Tramtrack, Bric-a-brac/Poxvirus, Zinc finger), а также предполагаемый сигнал ядерной локализации и области фосфорилирования [6].

Когда уровни SA низкие, NPR1 находится в своей олигомерной форме в цитоплазме, а в ответ на действие SA, регуляторный белок диссоциирует на мономеры, перемещается в ядро, и взаимодействует с факторами транскрипции TGA, тем самым, индуцируя экспрессию PR генов [6].

Для активации экспрессии гена PR-1 необходимы факторы TGA 2, 5 и 6. Для полной экспрессии данного гена необходим также фактор транскрипции WRKY70 [5].

Ядерная локализация NPR1 и активация TGA факторов возможно регулируются изменением окислительно-восстановительного потенциала клетки после обработки SA.

Когда белки были исследованы без восстановителя DTT, NPR1 обнаруживался только в обработанных SA образцах, тогда как при наличии DTT мономеры NPR1 были обнаружены в равных количествах с и без обработки SA [6].

Было установлено, что роль NPR1 в растениях не ограничивается SAR. NPR1 играет важную роль при ограничении роста патогенов. NPR1 также требуется для индуцирования другой защитной устойчивости (ISR), которая вызывается непатогенными, колонизирующими корни бактериями. NPR1 выступает посредником между пересекающимися сигнальными путями салициловой кислоты (SA), жасмоновой кислоты JA и этилена (C2H4), которые вызывают устойчивость к насекомым и некоторым некротрофным патогенам. NPR1 участвует в детоксикации SA и обратной регуляции ее биосинтеза. Кроме того NPR1 участвует в процессах, которые непосредственно не связаны с устойчивостью, например регуляция клеточного деления [6].


2. Объекты и методы исследования

Работа выполнялась на базе кафедры микологии и фитоиммунологии ХНУ им. В. Н. Каразина с 2008 по 2010 годы. Сбор материала проводился на территории Харьковской области в период с 2008 по 2009 годы.