Особенность такой транс-трансляционной системы состоит в том, что одна пептидная цепь синтезируется с двух различных молекул мРНК. Необходимо отметить, что способ установления рамки считывания (ОРС) матричной части тмРНК отличен от всех известных способов установления рамки считывания. Первая включаемая аминокислота не определена обычным кодон-антикодоновым взаимодействием, а аденозиновый остаток, отстоящий на 3 н. в 5'-направлении от первого транслируемого кодона, важен для транс-трансляции. В природных тмРНК этот аденозин находится в центре таких триплетов, как UАА и UАG, которые обычно узнаются с помощью фактора терминации. Возможно, для установления правильной ОРС тмРНК необходим фактор терминации. Это предположение требует дальнейшего экспериментального подтверждения.
С помощью тмРНК клетка решает две задачи: с одной стороны, освобождаются остановившиеся рибосомы, а с другой, неправильные белки быстро расщепляются специфической протеазой, узнающей сигнальный пептид, кодируемый матричной частью тмРНК. тмРНК активно исследуется на протяжении последних лет. Это связано с открытием процесса транс-трансляции, а именно с возможностью синтеза одного белка на основе двух различных мРНК. Способность тмРНК объединять в одной молекуле функции тРНК и мРНК и присоединять аланин из тРНК-части без обычного кодон-антикодонового взаимодействия делает тмРНК интересным объектом исследований. Кроме того, отсутствие тмРНК у высших организмов указывает на возможность ее использования в качестве хорошей мишени при создании новых антибактериальных средств. Функция тмРНК особенно важна для жизнедеятельности бактерий при повышенных температурах. Известно, что многие бактериальные инфекции сопровождаются повышением температуры, поэтому создание препарата, блокирующего функцию тмРНК, приведет к гибели бактерий и не повлияет на биосинтез белков человека.
I.4 Интерференция РНК
Одним из наиболее важных механизмов регуляции экспрессии генов является интерференция РНК. Регуляция экспрессии эукариотических генов может осуществляться на нескольких уровнях: во время транскрипции, на стадии процессинга РНК, при трансляции и на уровне созревания белка. В последнее время в связи с открытием явления интерференции РНК большое внимание ученых привлекает посттранскрипционный уровень регуляции.
Интерференция РНК - высокоспецифичный механизм подавления экспрессии гена на посттранскрипционном уровне за счет деградации считанной с него мРНК. Деградация мРНК происходит в результате комплементарного связывания комплексов, содержащих малые интерферирующие РНК (siРНК), которые относятся к семейству малых РНК, и белки, в том числе эндонуклеазы. Малые РНК - регуляторные некодирующие РНК размером от 19 до 28 н., образующиеся в клетке из более длинных двухцепочечных РНК (дцРНК). Малые РНК могут регулировать экспрессию генов не только посредством интерференции, но также подавляя трансляцию, транскрипцию или способствуя удалению гена-мишени из клеточного генома. Последнее наблюдается у некоторых простейших в процессе созревания макронуклеуса. Феномен интерференции РНК обнаружен у различных эукариотических организмов, в частности, у одноклеточных, низших грибов, растений, нематод, насекомых, а также у позвоночных, включая мышей и человека. Подобная высокая консервативность механизма интерференции РНК свидетельствует о его большой значимости. И хотя функции некоторых видов малых РНК до сих пор не установлены, предполагают, что основная их роль - защита генома клетки от внедрения мобильных генетических элементов (вирусов, транспозонов), а также участие в регуляции дифференцировки многоклеточных организмов.
Малые РНК представляют значительный интерес для фундаментальной молекулярной биологии и таких прикладных ее областей, как биомедицина и биотехнология. Одним из наиболее эффективных способов изучения функции гена является анализ фенотипа организмов, у которых этот ген не экспрессируется. Существует ряд методов, позволяющих подавлять экспрессию определенных генов, в том числе, использование антисмысловых олигонуклеотидов, рибозимов, химических блокаторов, а также разрушение нужного гена во всем организме путем внесения соответствующих мутаций в зиготу. Однако эти методики либо сложны, либо не всегда эффективны и не обеспечивают полного сайленсинга гена (т.е. подавления экспрессии) в экспериментальных моделях млекопитающих. В отличие от перечисленных методик, технологии, основанные на явлении интерференции РНК (деградация мРНК при введении в клетку соответствующих им 81РНК или экспрессирующих их конструкций), просты в исполнении, эффективны и обладают большой специфичностью распознавания молекулы-мишени.
Выделяют два основных типа малых регуляторных РНК: малые интерферирующие РНК (siРНК) и микроРНК (miРНК). Биохимически и функционально это молекулы практически неразличимы, и принцип их подразделения основан на природе предшественников.
siРНК - малые дцРНК длиной 19-25 п.н. образуются из длинных дцРНК.
miРНК - малые оцРНК длиной 18-24 н. образуются из внутримолекулярных двухцепочечных структур (шпилек) РНК-предшественниц, транскрибируемых с генов, содержащих повторяющиеся инвертированные последовательности (палиндромы).
По происхождению малые РНК можно разделить на экзогенные (индуцируемые или кодируемые вирусами, либо введенные искусственно) и эндогенные (образующиеся при транскрипции собственных генов клетки).
Сигналом для инициации интерференции РНК служит появление в клетке экзогенной (вирусной или введенной в ходе эксперимента) либо эндогенной (транскрибированной с собственных генов клетки) дцРНК. Эффективность интерференции РНК прямо зависит от длины молекулы дцРНК: чем длиннее дцРНК, тем больше siРНК образуется, и тем большее число сайтов-мишеней на молекуле мРНК будет распознано. Минимальный размер дцРНК, достаточный для индукции интерференции, - 26 п.н. Скорее всего, такое ограничение защищает от деградации собственную клеточную мРНК с короткими внутримолекулярными самокомплементарными структурами. дцРНК распознается и нарезается ферментом Dicer. Молекула Dicerсодержит N-концевой хеликазный домен - РАZ, функция которого не совсем ясна, парные РНКазные домены, а также расположенный на С-конце домен, необходимый для распознавания и связывания дцРНК. Предполагают, что расщепление дцРНК у млекопитающих осуществляется последовательно с одного конца молекулы. При этом происходит АТР-зависимая транслокация Dicerвдоль молекулы дцРНК.
В результате работы Dicerобразуются двухцепочечные siРНК длиной 20-25 п.н. (видоспецифический признак). Эти молекулы содержат гидроксильные группы на З'-концах и фосфатные на 5'-концах, а также по два выступающих неспаренных нуклеотида на З'-концах. Именно такая структура необходима для участия в последующих этапах процесса, приводящего к сайленсингу РНК. Молекулы с тупыми концами или с модификацией в 5'-концевой области активностью siРНК не обладают.
Следующие стадии интерференции - распознавание и фрагментация РНК-мишени. siРНК связывается с группой белков, образуя многокомпонентный нуклеопротеиновый комплекс RISC (RNA-inducedsilencingcomplex-комплекс, осуществляющий индуцированное РНК подавление активности гена). В состав комплекса RISCвходит белок семейства Argonaute - Аgо2, содержащий домены РАZи PIWI.
Данные рентгеноструктурного анализа свидетельствуют о сходстве пространственных структур домена PIWI и РНКазы Н. Очевидно, именно домен PIWI обусловливает эндонуклеазную активность всего комплекса. Предполагают, что функция РАZ состоит в распознавании и связывании siРНК, имеющих два неспаренных нуклеотида на З'-конце. RISC, связанный с двухцепочечной siРНК, неактивен. Для его активации необходимо расхождение цепей siРНК, катализируемое АТР-зависимой хеликазой .
Показано, что активный RISC содержит только антисмысловую цепь siРНК, комплементарную участку мРНК-мишени, что позволяет ему распознавать и связываться с последовательностью-мишенью на мРНК, комплементарной этой цепи. После этого входящая в состав комплекса RISC эндорибонуклеаза расщепляет молекулу мРНК-мишени на фрагменты длиной от 21 до 23 н..
У растений и червей может происходить амплификация siРНК. За это отвечает РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp). Используя в качестве затравки антисмысловую цепь siРНК, а в качестве матрицы - молекулу мРНК, этот фермент синтезирует новые дцРНК, которые затем превращаются в siРНК при участии Dicer. У этих организмов интерференции РНК имеет системный эффект, как следствие передачи сигнала из клетки в клетку или его доставки во все ткани организма. Такое явление называется системной супрессией. Передача дцРНК или siРНК у растений может происходить по цитоплазматическим мостикам из клетки в клетку или по системе сосудов.
Таким образом механизм интерференции РНК следующий: на первом этапе длинная дцРНК нарезается белком Dicer с образованием siРНК. Эта реакция протекает с использованием энергии АТР. Далее двухцепочечная siРНК связывается с группой белков, формируя нуклеопротеидный комплекс RISC (Этап 2). Один из его компонентов - АТР-зависимая хеликаза, которая раскручивает дуплекс siРНК. В результате в составе RISC остается только антисмысловая цепь siРНК (Этап 3). Такой модифицированный комплекс функционально активен. Активированный RISC распознает и связывает мРНК-мишень за счет комплементарного спаривания с ней антисмысловой цепи siРНК (Этап 4). Далее входящий в состав комплекса белок Аgо2 разрезает молекулу мРНК (Этап 5). У растений и нематод существует механизм амплификации siРНК. При этом РНК-зависимая РНК-полимераза синтезирует дцРНК на матрице мРНК, используя в качестве затравки антисмысловую цепь siРНК (Дополнительный этап). Новосинтезированные дцРНК разрезаются при участии Dicer, давая начало новому пулу siРНК [5].